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研究背景：慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是一种起源于髓系的获得性造血干恶性疾病,年发病率为1-2/10000成年人,约占新诊断的成人白血病的15%。在中国CML在白血病中居第三位,高于欧洲和美国。CML发病年龄主要集中在50-70岁,但在各年龄段甚至儿童均可发病。CML发病因素复杂,目前确切的致病因素仍然不明,目前认为主要包括环境和遗传因素两大类。在95%以上的CML患者中出现特征性Ph染色体或BCR-ABL融合基因,其编码具有酪氨酸激酶活性P210蛋白,最终导致不成熟髓系细胞极度增殖。多种癌基因、抑癌基因等功能基因参与CML的发生发展过程中,而这些功能基因的表达调控目前不是非常清楚。为了探讨更好的CML的诊断和治疗方法,有必要对其发生发展机制进行进一步研究。微小RNA (microRNA, miRNA)是一类非编码高度保守的小分子单链RNA,长度约为19-25核苷酸,广泛地在原核和真核细胞内特异性表达。miRNA通过与靶蛋白的信使RNA (mRNA)3’非编码区(untranslated region,UTR)互补识别,抑制其翻译或者直接切割降解,通过调控下游靶基因的表达而发挥生物学功效。迄今为止,人类基因组中共发现约1600个miRNA,据学者估计miRNA可调控人类1/3的基因表达。研究证实miRNA在白血病的发生发展起重要的作用,根据作用靶基因的不同,充当癌基因或者抑癌基因的角色。目前miRNA调控白血病的研究主要集中在急性白血病中,对于miRNA与CML联系的报道较少。miR-362-5p首先由Bentwich在哺乳动物中发现。文献报道miR-362-5p在肝细胞癌中高表达,并且抑制了圆柱状瘤基因的表达从而促进了肝癌细胞生长和转移。我们在前期的研究中发现miR-362-5p造血细胞前期阶段低表达,白血病细胞株中显著高表达。miR-362-5p的生物学功效在CML未见深入研究。细胞的快速增殖是实体肿瘤和白血病发展和维持的先决条件,其中涉及到许多调控基因的功能缺失和表达异常。GADD45a在多种恶性肿瘤扮演抑癌基因的角色,能抑制胰腺癌细胞增殖并且诱导细胞凋亡、周期阻滞；GADD45a与CML进展有密切的联系。那么在CML的发展中,高表达的miR-362-5p能否起到促进作用?miR-362-5p是否通过或者部分通过GADD45a起到调节作用?本课题将结合miR-362-5p在CML在细胞株和临床病例中的表达,人为改变miR-362-5p表达水平在体外及动物实验观察CML细胞在增殖、周期、凋亡和成瘤的变化；通过生物信息学预测以及分子实验验证GADD45a是否为miR-362-5p的靶基因,及GADD45a在CML中恶性生物学行为中的作用。探讨miR-3620在CML发病机制中的作用,为CML的诊断和临床治疗提供新的线索。研究目的：研究在CML细胞株和患者中miR-362-5p的表达情况,并探讨其在CML发病机制中的作用。研究内容：第一部分miR-362-5p在慢性粒细胞白血病中高表达与作用1.用qRT-PCR检测CML K562和BV173细胞株、45例未经治疗CML患者和26名健康对照、8名CML患者治疗前后miR-362-5p的表达情况。2.用功能缺失法(Loss-of-function)研究miR-362-5p生物学功能,即用阳离子脂质体法在K562和BV173中转染miR-362-5p inhibitor& negative control,下调miR-362-5p表达。随后：(1)CCK-8法检测K562和BV173细胞株的细胞增殖,并绘制生长曲线图。(2)流式细胞仪检测K562和BV173细胞株的细胞周期变化。(3) Annexin V/PI法检测K562和BV173细胞株的凋亡情况(4) Transwell/Matrigel法观察K562和BV173细胞株迁移和侵袭的能力。(5)软琼脂半固体集落形成法观察细胞独立性非锚着生长能力3.以慢病毒为载体建立稳定表达miR-362-5p inhibitor & negative control的K562细胞株,雌性裸鼠皮下注射,考察两组裸鼠移植瘤的生长速度、瘤体重量,免疫组化检钡GADD45a的表达。第二部分miR-362-5p与GADD45a作用靶点的预测及验证1. Targetsca、miRanda软件预测,双荧光酶素报告基因法验证miR-362-5p与GADD45a mRNA 3’UTR互补结合作用。2. Western blot检测抑制或者过表达miR-362-5p后GADD45a的变化。3.分析白血病细胞株和CML患者的GADD45a蛋白表达情况。4.在K562和BV173中转染miR-362-5p inhibitor,随后转染GADD45a干扰RNA,检测细胞增殖、凋亡能力。观察GADD45a干扰RNA能否对下调miR-362-5p的细胞表型变化产生中和效应。5.考察miR-362-5和GADD45a对细胞信号通路的影响。研究结果：第一部分1.与正常健康人群造血祖细胞CD34+比较,miR-362-5p在白血病细胞株尤其是CML细胞株K562和BV173中显著高表达(p<0.01)；在45例CML患者和相应的26例健康对照人群的检测中,CML患者中miR-362-5p显著高表达(p<0.01);8名CML患者血液学缓解后miR-362-5p明显下降(p<0.05)。2.转染miR-362-5p inhibitor后显著减低了K562和BV173中miR-362-5p表达水平,并且有效抑制CML细胞株的增殖、迁移、侵袭、软琼脂克隆形成能力,明显促进细胞凋亡和G1期阻滞。3.注射稳定抑制miR-362-5p表达的K562细胞(抑制组)的裸鼠移植瘤生长速度、瘤体肿瘤显著低于对照组(p<0.01)；抑制组GADD45a的表达量高于对照组。第二部分1.生物信息学分析显示在GADD45α mRNA3’UTR的92-98位置,具有一个与miR-362-5p完全互补的7个碱基的种子序列；通过构建和转染(GADD45α@ psi-CHECK2-Report-Luc质粒和miR-362-5p mimic/inhibito入细胞,导致了较对照组显著的荧光强度变化,证实了GADD45α是miR-362-5p的靶基因。2.过表达或者抑制miR-362-5p水平,相应的GADD45α蛋白水平出现下降或者升局。3.高表达miR-362-5p的白血病细胞株和CML患者中GADD45α蛋白呈现低水平；反之,低表达miR-362-5p的细胞株和健康对照人群中GADD45α蛋白呈现相对高表达。4.转染GADD45α干扰RNA后对下调miR-362-5p导致的细胞增殖、凋亡能力变化产生一定的中和效应。5.抑制：miR-362-5p表达后有效活化了K562和BV173细胞的P38/JNK信号通路,转染si GADD45α后对P38和JNK磷酸化水平有一定程度的抵消作用。结论：1. miR-362-5p的高表达促进CML细胞的增殖、迁移、侵袭和克隆形成能力,抑制了CML细胞的凋亡,其在CML中起到原癌基因的作用。2. miR-362-5p通过靶向抑制GADD45α的表达水平,进而影响了GADD45α依赖的CML中下游P38/JNK信号通路来产生上述功能变化。该研究为CML的分子靶向治疗提供了新的线索。