论文部分内容阅读
广州管圆线虫[Angiostrongylus cantonesis(Chen,1935)Doughert，1946]<[1,2]>寄生于人体时引起嗜酸性粒细胞增多性脑膜脑炎或脑膜炎(Eosinophilic meningitis ormeningoencephalitis,EM)<[3]>，是一种人兽共患食源性寄生虫病。广州管圆线虫对人体的侵害主要累及中枢神经系统，病情严重危害较大，如不及时治疗可引起严重后果甚至死亡。然而近年来广州管圆线虫病的流行已经由太平洋沿岸地区而波及美国、欧洲、澳大利亚等地区<[4]>，我国的福建、台湾以及其它地区曾发生了多次暴发流行<[5-10]>。因此广州管圆线虫病也引起了我国的广泛的重视，2003年卫生部将其列为新发传染病<[11]>。广州管圆线虫寄生于多种鼠类的肺动脉内，一期幼虫随宿主粪便一起排出体外，当被吞入或主动侵入中间宿主(螺类和蛞蝓等)体内后，在组织中发育为第二及第三期幼虫，人因生食或半生食含本虫幼虫的中间宿主或转续宿主而感染<1,12]>。广州管圆线虫的能量代谢与其他寄生虫相似，获取能量的重要方法就是无氧代谢，而3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)则是糖酵解过程中的一个重要酶，参与细胞的基本代谢。其催化3-磷酸甘油醛的醛基羧化而成为1，3-二磷酸甘油酸，在这一反应过程中产生一个ATP。GAPDH还是一个多功能酶，它还在细胞发育、神经细胞的凋亡和DNA的修复等过程中发挥重要作用<[13]>。此外，寄生虫的3-磷酸甘油醛脱氢酶具有一定的免疫原性<[14-17]>。本研究利用分子生物学的方法对广州管圆线虫的GAPDH基因进行生物信息学分析后克隆、构建原核表达载体pET-30a-(+)-GAPDH、大量表达后获得具有生物学活性的3-磷酸甘油醛脱氢酶目的蛋白，分析其免疫学活性，能否被感染的动物血清和病人血清特异性识别，并为广州管圆线虫病免疫学诊断的进一步研究奠定基础。研究目的本研究利用基因克隆和重组表达的方法构建广州管圆线虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的体外表达系统，获得大量的3-磷酸甘油醛脱氢酶重组蛋白，用免疫印迹和酶联免疫吸附反应的方法进一步分析免疫学活性，即目的蛋白作为抗原能否与广州管圆线虫病人的血清和感染动物血清特异性结合，以期为广州管圆线虫病的实验室诊断研究提供参考。
研究方法利用生物信息学方法对广州管圆线虫GAPDH基因序列进行分析，找出其开放读码框，PCR方法体外扩增该基因进行T-A克隆并进而构建原核表达载体pE﹪30a(+)-GAPDH，转化入大肠杆菌BL21，对融合蛋白进行表达。反复优化并得到最佳表达条件后，在原核表达系统中进行大量表达重组蛋白，制备细胞抽提物，经Ni-NTAHis·Brad Resin亲和层析柱进行蛋白质纯化，SDS-PAGE方法进行鉴定，免疫印迹和酶链免疫反应的方法分析其与广州管圆线虫病人血清和感染动物血清结合的敏感性和特异性。
研究结果获得了广州管圆线虫GAPDH基因完整的开放读码框，利用生物信息学的方法对该基因及其表达的蛋白质进行了分析。成功克隆并扩增目的基因，经过T-A克隆获得了高拷贝量的GAPDH目的基因，所构建的融合表达载体pE﹪30a-(+)-GAPDH成功转染入大肠杆菌BL21，经过反复优化表达条件该表达系统能够在28-30℃、IVTG终浓度0.7-0.8mmol/L诱导7h的条件下大量、稳定地表达目的蛋白，以非可溶性表达为主，在变性条件下纯化该目的蛋白后进行蛋白质复性，SDS-PAGE结果显示蛋白质纯化效率较好，成分纯净单一。以融合蛋白作为抗原，用免疫印迹和酶联免疫吸附反应的方法观察其与广州管圆线虫病人血清和感染动物血清结合的敏感性和特异性，结果表明该蛋白质有一定的免疫学活性，但与其它寄生虫病人或动物血清存有一定的交叉反应性。
结论获得了广州管圆线虫3．磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)的序列，初步对该基因进行了生物信息学分析，成功构建了该基因的原核表达体系。该目的蛋白能够与广州管圆线虫病人血清和感染动物的血清有结合反应，但与其它寄生虫病人或动物血清存有一定的交叉反应性，广州管圆线虫3-磷酸甘油醛脱氢酶融合蛋白作为特异性诊断抗原的可能性有待进一步的试验确定。