传疟媒介大劣按蚊和斯氏按蚊基因组DNA遗传多态性研究

• 作 者: 孙恩涛
• 机 构: 安徽理工大学
• 出 处: 安徽理工大学
• 发表日期: 2007年01期
• 关键词: 按蚊 疟原虫 遗传多态性 内转录第二间隔区 RAPD RFLP

目的比较对约氏疟原虫不易感的大劣按蚊和易感的斯氏按蚊基因组DNA遗传多态性,探讨媒介按蚊基因型与疟原虫基因型间的相互关系。方法应用随机扩增多态性DNA（Random amplified polymorphic DNA,RAPD）技术对大劣按蚊和斯氏按蚊雌性成蚊基因组DNA进行分析,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,分析比较结果。从5条随机引物中筛选出重复性好、谱带清晰并呈多态性的引物,对迁移率相同的DNA条带进行回收、纯化,与pMD-18T载体连接,转化入大肠杆菌XL1-blue,经PCR鉴定后,目的基因测序,采用相关在线程序及软件进行序列比较分析;同时,对大劣按蚊和斯氏按蚊核糖体基因内转录第二间隔区（rDNA ITS₂）进行PCR扩增,应用限制性片断长度多态性分析（Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP）技术分析PCR产物,并回收、纯化扩增的目的基因片段,经TA克隆后测序鉴定,采用相关软件进行序列比较分析。在GenBank数据库中查找其它传疟按蚊的rDNA ITS₂序列,用Clust W软件进行多序列比对,MEGA软件构建分子系统树。结果大劣按蚊和斯氏按蚊RAPD谱带具有明显的种间差异,其中引物P3、P4和P5对两种按蚊成蚊基因组DNA进行RAPD扩增,均扩增出清晰、稳定性好、多态性丰富的谱带。引物P4对两种按蚊基因组DNA扩增,有4对迁移率相同的DNA条带。序列比较分析显示此4对DNA条带在序列长度和组成上均呈现多态性,碱基差异水平为60.0%～61.9%;序列的GC含量和简单重复序列（SimpleSequence Repeat,SSR）具有明显多态性。同时,大劣按蚊和斯氏按蚊ITS₂序列的PCR扩增产物经限制性内切酶Xho I消化,产生不同的酶切图谱,存在基因多态性。测序结果显示大劣按蚊和斯氏按蚊ITS₂基因分别为715bp和466bp,两者碱基差异水平为53.5%;两种按蚊ITS₂序列的GC含量和简单重复序列也存在明显的多态性。分子系统树显示,大劣按蚊和斯氏按蚊形成单独的支系。结论大劣按蚊和斯氏按蚊基因组DNA序列间存在多态性,其基因的多态性可能与大劣按蚊和斯氏按蚊对约氏疟原虫产生不同的易感性相关。大劣按蚊和斯氏按蚊间存在不同的遗传背景,为进一步研究按蚊基因型与疟原虫基因型之间的相互作用奠定基础。