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硝基芳烃化合物是一种重要的化工原料，常用于医药、染料和农药等化工产品的合成。由于应用广泛，大量的硝基芳烃化合物通过各种途径被释放到环境中并造成严重的环境污染。4-硝基酚是硝基芳烃化合物的一种典型代表，由于其水溶性好，稳定性强，能在环境中长期存在而被美国环境保护署列为优先污染物。目前关于4-硝基酚的微生物降解已经在分子、生化和遗传学水平上进行了深入的研究。2-氯-4-硝基酚在结构上属于4-硝基酚的一种化学类似物，由于苯环上同时取代硝基和氯离子，2-氯-4-硝基酚相比4-硝基酚更难降解。迄今为止，关于2-氯4-硝基酚的微生物降解仍然停留在菌株的筛选以及代谢途径的鉴定，没有任何分子生物学和生化水平的相关报道。 目前报道有4株菌能利用2-氯4-硝基酚为唯一碳源和能源进行生长，并鉴定了3条不同的代谢途径，但是这些代谢途径都没有得到遗传和生化水平上的鉴定。本研究选取革兰氏阴性菌Burkholderia sp.strain SJ98(DSM23195)和革兰氏阳性菌Rhodococcus imtechensis RKJ300(DSM45091)，首次从分子生物学和生化水平上对2-氯-4-硝基酚的代谢途径进行研究。 本论文第一部分为革兰氏阴性菌Burkholderia sp.strain SJ98(DSM23195)降解2-氯-4-硝基酚的代谢机理研究。SJ98菌株除了降解2-氯-4-硝基酚，还能利用4-硝基酚为唯一碳源和能源生长。本研究通过HPLC和GC-MS对SJ98菌株降解2-氯-4-硝基酚和4-硝基酚的代谢产物进行鉴定。结果显示SJ98菌株在降解2-氯-4-硝基酚的过程中检测到中间代谢产物2-氯-对苯二醌和2-氯-对苯二酚，在降解4-硝基酚的过程中检测到的中间代谢产物对苯二醌和对苯二酚。S98菌株降解2-氯-4-硝基酚和4-硝基酚代谢途径相似，而且生物转化发现无论是2-氯-4-硝基酚还是4-硝基酚诱导的SJ98细胞都能同时降解这两种底物，推测该菌株中参与这两种底物代谢的酶是共用的。随后通过基因组步移的方法从SJ98菌株中克隆了一段可能参与这两种底物代谢的核苷酸序列（pnpABA1CDEF基因簇）。其中pnpA和pnpA1编码4-硝基酚单加氧酶，pnpB编码对苯二醌还原酶，pnpC和pnpD分别编码对苯二酚双加氧酶的α和β亚基，pnpE和pnpF子别编码4-羟基粘康酸半醛脱氢酶和马来酰乙酸还原酶。操纵子结构分析显示np基因簇的全部基因位于同一个操纵子，而在已经报道的所有革兰氏阴性4-硝基酚降解菌中，参与4-硝基酚代谢的结构基因位于三个不同的操纵子。转录水平分析结果显示2-氯-4-硝基酚和4-硝基酚都能诱导pnp基因簇的转录，说明pnp基因簇极有可能同时参与2-氯-4-硝基酚和4-硝基酚的代谢。随后将pnp基因簇所编码的蛋白在大肠杆菌中分别进行表达和纯化。酶学分析和产物鉴定证明PnpA可以催化2-氯-4-硝基酚和4-硝基酚的单加氧反应，并分别生成2-氯-对苯二醌和对苯二醌。PnpB可以催化2-氯-对苯二醌和对苯二醌的还原，并分别生成2-氯-对苯二酚和对苯二酚。而且PnpB在体外可以明显增强PnpA的活力。基因敲除和互补显示pnpA基因是菌株SJ98降解2-氯-4-硝基酚和4-硝基酚所必需的基因。通过顺序催化还发现PnpCD、PnpE和PnpF同时参与了2-氯-4-硝基酚和4-硝基酚的下游代谢途径。 本论文第二部分为革兰氏阳性菌Rhodococcus imtechensis RKJ300(DSM45091)降解2-氯-4-硝基酚的代谢机理研究。除了2-氯-4-硝基酚，RKJ300菌株还能利用4-硝基酚为唯一碳源和能源生长。GC-MS鉴定结果显示该菌在降解2-氯-4-硝基酚过程中生成中间代谢产物2-氯-对苯二酚和偏苯三酚，在降解4-硝基酚的过程中生成对苯二酚和偏苯三酚。2-氯-4-硝基酚或4-硝基酚诱导后的RKJ300细胞都能同时降解这两种底物，说明该菌株中参与4-硝基酚代谢的酶也可能参与2-氯-4-硝基酚的降解。分析RKJ300菌株的基因组序列，发现一段可能参与这两种底物代谢的基因簇pnpA1A2BC。pnpA1和pnpA2分别编码双组分4-硝基酚单加氧酶的氧化酶组份(PnpA1)和还原酶组份(PnpA2)，pnpB编码偏苯三酚1，2-双加氧酶，pnpC编码马来酰乙酸还原酶。转录水平分析显示无论是2-氯-4-硝基酚还是4-硝基酚诱导，pnp基因的转录水平相比未诱导条件下都显著上升。将PnpA1和PnpA2分别在大肠杆菌中表达并纯化。酶学分析和产物鉴定证实PnpA1A2除了可以催化4-硝基酚氧化生成对苯二酚和偏苯三酚外，还能催化2-氯-4-硝基酚的氧化，并检测到2-氯-对苯二酚和偏苯三酚的生成。此外，PnpA1 A2还能分别催化2-氯-对苯二酚和对苯二酚的单加氧反应，并且都生成偏苯三酚。这一系列酶催化反应说明PnpA1A2在RKJ300菌株降解2-氯-4-硝基酚的过程中具有氧化脱氯的功能。很多革兰氏阳性菌降解4-硝基酚的过程中都会检测到对苯二酚的生成，但是对苯二酚是如何进一步降解一直没有报道。本研究发现PnpA1A2还能催化对苯二酚氧化生成偏苯三酚，首次阐明了革兰氏阳性菌降解4-硝基酚过程中对苯二酚的去向这一科学问题。基因敲除互补证实pnpA1编码基因是RKJ300菌株利用2-氯-4-硝基酚和4-硝基酚所必需的基因。 本研究首次在分子生物学和生物化学水平上阐明了2-氯-4-硝基酚的微生物降解机制。并且证实了无论是在革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌株中，2-氯-4-硝基酚和4-硝基酚在代谢时都共用一套完整的基因簇。