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1.研究背景和目的
四环素基因调控系统(Tet-off system)是将原核生物基因调控元件导入真核生物基因调控区域构而建成的一种基因表达调控系统。本实验室已成功构建了质粒pTre-IFN-γ，并证实Tet-off系统能在体外调控人γ-干扰素(Interferon-gamma，IFN-γ)基因在小鼠骨髓基质细胞(marrow stromal cells，MSCs)中的表达。本实验进一步研究Tet-off系统体外调控的可逆性，以及其在小鼠体内对人γ-干扰素(Interferon-gamma，IFN-γ)基因在MSCs中的表达的调控作用。
2.实验方法
2.1扩增质粒摇菌扩增分别被质粒pTet-off和pTre-IFN-γ转染的大肠杆菌，大量提取质粒pTet-off和pTre-IFN-γ，保存于-20℃备用。
2.2无菌培养骨髓基质细胞并传代备用用含胎牛血清的DMEM培养基无菌培养BALB／c小鼠股骨和胫骨的骨髓基质细胞(MSCs)，并传代获得的第2～3代MSCs代备用。
2.3脂质体法介导质粒共转染小鼠MSCs，用ELISA法验证、检测共转染。
用Lipofectamine 2000脂质体介导质粒pTet-off和pTre-IFN-γ共转染至小鼠MSCs，用EIASA法检测MSCs培养液中人IFN-γ蛋白的分泌量。
2.4回输已共转染的骨髓基质细胞到BALB／c裸小鼠体内把24只BALB／c裸小鼠随机分成1、2、3、4四组，把成功共转染的MSCs通过尾静脉等量回输给1、2、3组的BALB／c裸小鼠，用不同的四环素处理方法饲养50小时。
2.5用实时荧光定量RT-PCR检测裸鼠脾组织中的人IFN-γ mRNA含量饲养50 h后用颈椎脱臼法处死裸鼠，迅速分别冻存每只小鼠的肝、脾组织，然后分别提取每只裸鼠100mg脾组织的总RNA，用实时荧光定量RT-PCR方法检BALB／c裸小鼠脾组织中的IFN-γ mRNA含量。
2.6统计学分析结果用SPSS10.0软件进行统计学分析，计量资料以均数士标准差表示，组间比较用单因素方差分析。
3.结果
用ELISA法可检测到共转染后的MSCs培养液中有IFN-γ蛋白分泌，分泌高峰在前72 h内，前48 h每1×107个细胞分泌量为(1896.69±128.78)pg，第三个24 h为(772.00±69.28)pg，以后逐渐下降；共转染后84 h加入含300 ng／ml盐酸四环素的培养液培养12 h，每1×107个细胞的分泌量为(67.11±22.14)pg，无四环素处理组为(319.96±29.04)Pg(P=0.000);去除四环素作用后培养24小时，IFN-γ蛋白分泌量显著增加，在去除和维持四环素处理组分别是(114.80±36.74)pg和(45.58±19.95)pg，(P=0.032)。
用实时荧光定量RT-PCR可检测到回输共转染MSCs的各组BALB／c裸小鼠脾组织中均有IFN-γ mRNA转录，不用四环素处理组最高，达(1.5×105±0.73x105)copy-(100mg)-1，定期四环素处理组为(6.9×102±5.3×102)copy·(100mg)-1(P=0.000)，接受1次四环素处理组表达量介于前两者之间，差异均有统计学意义。
4.结论
Tet-off系统在体外和体内都可以迅速、有效地调控人IFN-γ基因在小鼠骨髓基质细胞中表达，而且调控是可逆的。