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α-酮酸作为氨基酸的结构类似物,是治疗尿毒症的有效药物。7-氨基头孢烷酸是头孢菌素C的母核,是生产临床半合成头孢菌素类抗生素的关键原料。目前,这两种产品的酶法合成所使用的催化剂主要是固定化形式的D-氨基酸氧化酶和过氧化氢酶。由于固定化酶的制备成本较高,导致产品的生产成本提高。利用全细胞作为生物催化剂进行酶促反应,被认为是解决这个问题的一个有效途径。本论文对利用透性化毕赤酵母细胞制备α-酮酸与7-氨基头孢烷酸进行了研究,为这两种产品的工业化生产探索经济实用的新工艺路线。
发酵罐上通过对重组毕赤酵母的高密度发酵,D-氨基酸氧化酶和过氧化氢酶的表达量分别达到12532U/L和684800U/L(以CTAB透性化细胞酶活力计算),菌体含量达到42.8gDCW/L,远高于摇瓶培养的结果,表明发酵罐培养该重组酵母,能够更好地调控菌体生长与酶表达,有利于大规模放大生产。
细胞的透性化研究表明,透性化效果越好,透性化细胞D-氨基酸氧化酶和过氧化氢酶的稳定性就越低;透性化细胞D-氨基酸氧化酶和过氧化氢酶的稳定性与酶的表达量无关,而与细胞的培养方式有关;戊二醛处理透性化细胞不能有效地提高D-氨基酸氧化酶和过氧化氢酶的稳定性;碱、热处理透性化细胞能有效地失活过氧化氢酶和酯酶,却对D-氨基酸氧化酶的稳定性没有影响;在30℃的条件下,CTAB透性化毕赤酵母细胞D-氨基酸氧化酶和过氧化氢酶的半衰期分别达到14.5d和4.0d,这是迄今为止报道的这两种酶在透性化细胞中的最高热稳定性。
在制备α-酮酸的研究中,透性化毕赤酵母细胞催化D-苯丙氨酸转化生成99.5%苯丙酮酸,反应产物中没有副产物——苯乙酸出现,透性化细胞可以有效地重复使用13个反应循环。以透性化毕赤酵母细胞制备α-酮酸,在生成率、反应速率及操作稳定性方面与相关文献报道相比都具有较大的优势,有很好的工业化生产前景。
经碱、热处理的透性化毕赤酵母细胞与固定化GL-7-ACA酰化酶两步酶法制备7-ACA的研究中,CPC在第一步酶促反应中裂解生成92%GL-7-ACA,所获得GL-7-ACA在第二步酶促反应中转化生成82.8%7-ACA。然而两种催化剂协同作用一步法制备7-ACA时,等量CPC在2.5h内被转化生成90.9%7-ACA,反应过程无GL-7-ACA生成。结果说明一步法制备有助于减少中间产物的生成,提高酶促反应的速率,从而提高7-ACA产率。反应过程中对损失的D-氨基酸氧化酶流加透性化细胞悬液进行补偿,等量CPC在2h内转化生成90.5%7-ACA,反应体系中透性化细胞和固定化酶可以有效地重复使用4个和7个反应循环。该反应系统最大的优势就是做到有选择地丢掉任何一个酶活力已经损失的催化剂,避免仍可用的催化剂的浪费。
双酶一步法制备7-ACA的反应体系中存在的过氧化氢容易使参与反应的酶失活,而由透性化细胞D-氨基酸氧化酶、过氧化氢酶和固定化GL-7-ACA酰化酶组成的三酶系统,可以在无过氧化氢存在的条件下转化CPC一步法制备7-ACA。研究结果发现,等量CPC在2.5h内被转化生成76.2%7-ACA。该反应体系中催化剂的操作稳定性明显提高,在流加透性化细胞悬液的条件下,透性化细胞和固定化酶可以有效地重复使用6个和15个反应循环。较低的7-ACA生成率的获得是由于GL-7-ACA酰化酶对AKA-7-ACA水解速率较低的原因。通过微生物筛选或基因改造技术对这个问题加以解决,将使得三酶系统一步法制备7-ACA的工艺路线具有更诱人的工业化前景。