论文部分内容阅读
背景与目的:肝细胞肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，在我国居恶性肿瘤死亡率第二位。转移一直是影响肝癌预后的重要因素。肝癌细胞获得侵袭转移能力，与其所在的肿瘤微环境是密切相关的。缺氧是实体肿瘤发展过程中的常见现象之一。研究认为缺氧微环境可以诱导肿瘤细胞发生上皮间质转化、生成新生血管和促进肿瘤侵袭和转移。趋化因子是一族分子量为8-14kDa大小的趋化作用的细胞因子，通过与其相应受体结合，发挥调节白细胞趋化到炎症部位的作用。近来不断有研究证实趋化因子及其受体在肿瘤的生长，侵袭，血管生成和转移中起到重要的作用。已有研究报道CCL2和CCR2与肿瘤转移有关，但是其他趋化因子在肿瘤发展中的作用仍知之甚少。本研究着重于探索CCL28在缺氧诱导的人肝癌转移过程中作用。 方法:应用实时定量PCR检测50例肝细胞癌组织中CCL28和HIF-1αmRNA表达情况并分析两者表达的相关性，运用卡方检验，Kaplan-Meier分析HIF-1α及CCL28表达与年龄、性别、乙肝病毒标记物、肝硬化、分化、包膜、甲胎蛋白等临床病例特征及患者总体生存时间的关系;同时在体外细胞实验中，采用实时定量PCR，Western blot与酶联免疫吸附实验(ELISA)检测缺氧对肝癌细胞株HepG2、HCCLM3 HIF-1α和CCL28表达的影响;运用RNA干扰（siRNA）和Lipofectamine2000细胞转染技术下调HIF-1α基因表达对肝细胞癌HCCLM3细胞CCL28蛋白表达的影响。通过抑制CCL28表达，结合Transwell和BDMatrigel观察CCL28在缺氧诱导的肝癌细胞侵袭迁移中的作用;采用明胶酶谱法测定CCL28-siRNA干扰后细胞上清的金属蛋白酶含量的差异。 结果:1）实时定量PCR结果发现癌组织中HIF-1αmRNA含量0.0654±0.0988，29/50(58％)例呈高表达。CCL28mRNA水平在肝癌组织为0.0254±0.0755，23/50(46％)例呈高表达。Spearman双变量相关性分析显示肝细胞癌组织中CCL28与HIF-1α mRNA水平呈高度相关(r=0.595，p＜0.001);二者表达水平增高皆与术后复发相关。 2)体外细胞实验显示肝癌HepG2和HCCLM3细胞HIF-1α和CCL28mRNA水平在缺氧(1％O2)培养6h后开始增加，二者的蛋白表达水平在缺氧培养12h后开始增高，并呈现出时间依赖性。利用HIF-1α特异性siRNA阻断HIF-1α的表达后，CCL28蛋白的表达水平则随着HIF-1α表达抑制而减少; 3)利用siRNA抑制HCCLM3细胞内CCL28表达，经实时定量PCR和ELISA证实mRNA和蛋白水平明显降低。研究发现干扰HCCLM3细胞内CCL28表达后，缺氧条件下迁移和穿膜细胞数目较空白组减少，细胞MMP-2的分泌也减少。 结论:1）HIF-1α和CCL28在肝癌组织中mRNA表达增高，且表达水平呈高度相关性。二者表达水平增高皆与术后复发相关。 2)缺氧可通过HIF-1α上调肝癌细胞CCL28表达，且呈时间依赖性。 3)下调CCL28导致缺氧诱导的肝癌细胞侵袭力减弱。 4) CCL28在缺氧诱导的肝癌细胞侵袭转移中发挥作用，可能与MMP-2的分泌有关。