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肿瘤的生长，转移依赖于周围血管的生成，当肿瘤组织生长到2mm3时，必须血管供给营养才能继续生长，否则肿瘤细胞会“饿死”。目前，已经发现了很多血管生成抑制剂如endostatin, restin ,tumstatin,canstatin, arresten等, 它们都能抑制肿瘤生长，endostatin在美国即将上市。其中arresten是最新和研究最少的一个血管生成抑制肽。Arresten是四型胶原α1链的NC端，分子量为26kD,等点电6.4，为229个氨基酸，Colorado发现它能抑制内皮细胞的增殖和新血管的生成。本课题运用基因克隆技术，克隆和表达了arresten基因。首先用Trizol从汉族人肝脏提取总RNA，逆转录合成cDNA第一链。 使用软件RNASTRUCTRUE3.5分析四型胶原的α1链的cDNA，发现arresten基因能形成复杂的二级结构，严重影响PCR扩增时引物与模板的配对，故采用巢式PCR扩增arresten基因。利用一步法克隆新技术构建表达质粒，并转染到大肠杆菌中进行表达。第一部分：一步法克隆新技术利用T4 DNA Polymerase 的3’-5’的外切活性，使PCR扩增产物经过它处理形成的粘性末端，直接与酶切的表达载体pTYB1连接，转化大肠杆菌ER2566，IPTG诱导表达，结果在SDS-PAGE观察到有一26kD大小的目的条带。 第二部分： 采用传统的T-A克隆法，将arresten基因与T载体pGEM-T重组，构建了质粒pGEM-arresten，转染大肠大肠杆菌XL-GOLD。然后利用亚克隆技术，将arresten重组入穿梭质粒 pPIC9，转化大肠杆菌XL-GOLD，扩增，提取重组质粒，SacI酶切线形化重组质粒pPIC9-arresten，再转化PEG-1000制备的感受态毕赤酵母GS115，1%甲醇诱导表达，取上清作SDS-PAGE电泳，观察到有一26kD大小的目的条带，表明arresten基因整合到毕赤酵母基因组DNA中。 Arresten基因在毕赤酵母的最佳表达时间为72小时，此时重组arresten的表达量呈平台。收集培养上清，用孔径0.5 μm尼龙膜过滤，滤液上Sephadex G-25柱脱盐，冷冻干燥浓缩，Bradford 染料结合法定总蛋白量。表达的重组arresten 经初步纯化后， 对内皮细胞在Matrigel上增殖和血管<WP=11>化有明显的抑制作用。结果：1， 成功地用一步法克隆了arresten的cDNA，转化大肠杆菌， 用终浓度为0.5mmol/ＬIPTG，30℃诱导５小时，获得arresten高效表达。2， SDS-PAGE电泳分析毕赤酵母表达的重组arresten，分子量与预期一致。3， 在30℃，1%甲醇诱导毕赤酵母72小时， arresten表达量约30-50mg/l。故72小时为最佳诱导表达时间。4， 50ug含arresten的浓缩物，能抑制肿瘤细胞MDA-MB-435S诱导的内皮细胞的管索化或网状化形成。结论：1， 一步法克隆arresten cDNA成功地在大肠杆菌表达；2， 毕赤酵母成功、高效表达了arresten；3， 初步试验确定表达的arresten具有抑制新血管生成的生物学活性。