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实验目的: 1.确定成体干细胞标记物Lgr5对细胞重编程的作用。 2. LGR5作为G蛋白偶联受体，是否存在合适配体参与影响细胞重编程。 3.探究LGR5影响细胞重编程的机制。 4.利用LGR5对细胞重编程的影响解决生物医学难题。 实验方法: 首先采用qPCR的技术手段，检测Lgr5在小鼠各个组织细胞中的表达情况，根据表达情况构建过表达载体或者敲低表达载体，过表达载体我们选择构建在可以被强力霉素（Doxycycline，Dox）控制表达的pFUW-tet-on载体上，利用293T细胞以及psPAX2和pmd2.G的病毒包装质粒实现病毒的包装和获得，利用病毒感染的方式，直接感染小鼠胚胎多能性干细胞或者建立Lgr5过表达的稳转小鼠胚胎多功能干细胞细胞株，在此基础上探测Lgr5过表达对小鼠胚胎多能干细胞的影响，同样Lgr5的敲低表达载体按照同样的方法。对于小鼠胚胎多能干细胞的影响，我们主要通过观察细胞物理形态和检测多能干细胞的多能标记基因（marker）Nanog、Oct4、Rex1、Fgf5等。针对Lgr5对细胞重编程的影响，我们利用小鼠的胚胎成纤维细胞作为体细胞重编程的起始细胞，利用已经成功建立的诱导体系，获得能够直接添加强力霉素启动内源Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc表达来诱导细胞发生重编程的小鼠胚胎成纤维细胞，利用病毒感染的方法完成对此细胞Lgr5的过表达或者敲低，进而进行细胞重编程，对重编程得到的克隆的形成的速率和效率进行统计比较，密切观察记录细胞出现克隆的日期。为了探究Lgr5影响细胞重编程的机制，我们筛选了跟Lgr5相关的一些蛋白。LGR5作为G蛋白耦联受体，参与Wnt信号通路，而Wnt信号通路对于细胞干性维持有重要作用，RSPO3作为LGR5的同源配体，与其共同作用参与Wnt信号通路，同样方法检测Rspo3过表达对于重编程效率和小鼠胚胎多能干细胞的影响。利用荧光定量PCR和Western Blot在RNA水平和蛋白水平检测Wnt通路中核心因子β-catenin的相关变化。利用ChIP-seq深度解析不同类型细胞中关键转录因子结合的DNA序列，分析LGR5和RSPO3参与Wnt通路调控的下游靶基因，揭示Lgr5在细胞重编程中的作用机制。 实验结果： 1. Rspo3过表达能够促进小鼠胚胎成纤维细胞的重编程效率。 2. Lgr5和 Rspo3在小鼠胚胎干细胞中过表达后能够上调胚胎干细胞多能性标记基因的表达。 3.在小鼠胚胎干细胞中过表达Lgr5基因，Wnt通路的核心蛋白β-catenin表达水平上升。 实验结论： Lgr5与Rspo3过表达协同促进小鼠胚胎成纤维细胞重编程，维持小鼠胚胎干细胞多能性。