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甘露聚糖是植物细胞壁半纤维素的重要成分之一,β-甘露聚糖酶(endo-β-mannanase,E.C.3.2.1.78)是分解甘露聚糖的主要酶类。水稻种子的萌发与细胞壁的分解相关,主要包括胚乳组织与糊粉层中细胞壁的降解。因此,深入研究粳稻和籼稻种子萌发过程中β-甘露聚糖酶的表达,对探索水稻种子的萌发过程中β-甘露聚糖酶的作用机理具有重要意义。本文以籼稻品种“博优3550”(Oryza sativa L.cv.Boyou3550,an indica subspecies)和粳稻品种“台中65”(Oryza sativa L.cv.Taizhong 65,a japonica subspecies)为材料,对种子萌发过程中β-甘露聚糖酶在酶活水平,同工酶水平以及酶蛋白水平的表达情况进行探讨,此外,本文还从植物激素GA与ABA对β-甘露聚糖酶的酶活性与酶蛋白的调控作用进行了初步研究。本研究取得了以下的主要结果:
通过凝胶扩散法对β-甘露聚糖酶活性测定表明,籼稻种子与粳稻种子在萌发前没有β-甘露聚糖酶活性的出现。种子萌发后,粳稻“台中65”的整粒种子在吸水48 h出现酶活性,到96h时酶活性达到最大值,然后酶活性减弱;籼稻“博优3550”整粒种子在吸水36 h就已经检测到酶活性,到60 h时达到最大值然后减弱。在粳稻“台中65”种子的不同组织中,酶活性首先在糊粉层与盾片中出现,然后扩散到胚乳;籼稻“博优3550”中糊粉层、盾片与胚乳的酶活性出现时间相同。
在水稻种子萌发过程中β-甘露聚糖酶同工酶的检测中发现,同工酶种类随着萌发进程先增多然后减少。在粳稻“台中65”的整粒种子中共检测到五种β-甘露聚糖酶同工酶,等电点分别pI 8.62,pI 8.74,pI 8.86,pI 8.92和pI 8.98;在籼稻“博优3550”的整粒种子中检测到六种同工酶,与粳稻“台中65”相比缺失pI 8.98的同工酶,产生了pI 8.44和pI 8.50的同工酶。在糊粉层中,粳稻“台中65”检测到三种同工酶,籼稻“博优3550”比粳稻“台中65”多三种同工酶的出现;在胚乳中,粳稻“台中65”同样检测到三种同工酶,籼稻“博优3550”则出现五种同工酶。
用50 μMGA与1μMABA处理水稻种子发现,GA能诱导种子中β-甘露聚糖酶活性的提前出现与增强其活性,ABA能推迟其出现的时间与减弱其活性。在同工酶的研究发现,粳稻“台中65”整粒种子用GA处理可诱导出新的同工酶,等电点pI8.44;ABA处理可把同工酶种类减至两种。GA与ABA在萌发率、酶活性与同工酶上,对粳稻“台中65”调控的灵敏度高于籼稻“博优3550”。通过水稻种子中β-甘露聚糖酶与大豆β-甘露聚糖酶多克隆抗体的酶活性反应测定,确定两者能发生免疫亲和反应。在用大豆抗体与粳稻“台中65”种子β-甘露聚糖酶蛋白的Western blot结果发现,水稻种子酶蛋白β-甘露聚糖酶蛋白的分子量大小约46.5 kDa。酶蛋白在吸水12 h已经出现,随后酶蛋白的含量随着萌发进程呈先增强后减少的趋势。其中,糊粉层与胚乳组织在整个萌发过程中酶蛋白含量变化不大。
对萌发不同时间水稻种子进行冰冻切片,然后Western blot组织印迹研究发现,酶蛋白的含量组织变化与上述Western blot结果相符。在种子吸水12 h时β-甘露聚糖酶蛋白已经出现在盾片、糊粉层与近胚的胚乳。到24h时已经扩散到整粒种子,48~72 h时酶蛋白含量达到最大,而到84 h时整粒种子的酶蛋白量明显减少,近胚的少量胚乳组织酶蛋白消失。96 h时酶蛋白量进一步减少,且近胚的缺失酶蛋白胚乳组织区域扩大,远离胚的胚乳组织也开始有酶蛋白消失。