论文部分内容阅读
重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus，rAAV)载体以其靶细胞多样、定点整合、非致病性以及免疫反应轻微等优势，日益成为一种有效的肿瘤基因治疗的病毒载体。但腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)是复制缺陷性病毒，其自身扩增需在辅助病毒的刺激下才可完成。目前三质粒共转染制备系统可在无辅助病毒刺激下完成rAAV的复制过程。该系统中包装细胞为人胚胎肾细胞293系(Human embryonic kidney 293 cell line，HEK-293)，是经5型腺病毒(Adenovirus 5，Ad5)75系转化，含有Ad5 E1区基因序列，用于腺病毒载体或腺相关病毒载体包装复制的包装细胞系。该细胞系最早由Graham教授于1976年用DNA转染技术构建而成。三质粒系统包括：1)含有腺相关病毒两侧倒置末端重复序列(inverted terminal repeat，ITR)以及完整的目的基因表达元件盒的质粒pAAV-cDNA；2)含有编码Rep(病毒复制)和Cap(病毒包装)蛋白基因的质粒pAAV-RC；3)含有腺病毒基因组中E2a、E4和VA RNA序列的辅助质粒pHelper。因此，本论文研究内容包括：无血清悬浮培养驯化HEK-293细胞系、无血清培养液组分优化及HEK-293细胞系生长特性研究、三质粒共转染HEK-293细胞的悬浮工艺优化，以及转染后HEK-293生长代谢特性对rAAV病毒载体产量的影响等，结果如下：
1)采用逐步降低培养液中血清浓度的方法对HEK-293细胞进行低血清培养驯化。通过在细胞对数生长期更换含低浓度血清的培养液或传代操作，HEK-293细胞可完全适应含5％新生牛血清的DMEM的营养条件，HEK-293细胞可营正常贴壁生长。然后再逐步适应2％新生牛血清的营养条件，初次培养于该条件的HEK-293细胞伪足不伸展，且细胞之间形成较大团块，贴壁时间明显延长。经过在该血清浓度下10次传代后，HEK-293细胞虽可贴壁生长，维持较高的存活率，但贴壁较松，呈现出由贴壁生长向悬浮生长的过渡状态。
2)采用Plackett-Burman设计，利用20组实验对HEK-293细胞的无血清培养液中的14种营养成分进行优化，结果发现：progesterone、anti-oxidant reagent、ethanolamine、VB6、VB12和fatty acid reagent对HEK-293细胞无血清悬浮生长的比生长速率有显著影响。针对该6个因素进行Central Composite Rotatable Design实验设计，筛选出6种显著影响因素的最优使用浓度，分别为progesterone 5.5 mg/L、anti-oxidant reagent 250μl/L、ethanolamine 2.1 ml/L、VB12 2.86 mg/L、VB6 44μg/L和fatty acid reagent 215 μl/L。结合其他8种组分经Plackett-Burman实验筛选出的浓度，最终初步确定HEK-293细胞无血清悬浮生长的培养液，命名为FSFM。
3)通过逐步驯化，HEK-293细胞可逐渐适应无血清的营养条件及振荡培养条件在摇瓶中悬浮生长，然而HEK-293细胞在两种无血清培养液中的生长状态存在明显差异。3×105cells/ml的HEK-293细胞接种于FSFM培养液中，其中葡萄糖初始浓度为16.7mmol/L，谷氨酰胺初始浓度为4.0mmol/L，随着培养时间的延长，细胞结团逐渐增大，培养后期细胞团直径可达到300-400μm。但是5×105cells/ml的HEK-293细胞接种于Ex-cellTM293SFM培养液中，始终呈现为单细胞悬浮生长的状态。鉴于此，HEK-293细胞的无血清悬浮生长可以考虑先后应用该两种培养液，即低密度的HEK-293细胞先接种于FSFM培养液中，培养3天后加入一定量的Ex-cellTM 293SFM培养液可有效解聚细胞结团，同时也可在培养后期获得较高的细胞密度，并维持良好的细胞存活状态，为随后的悬浮转染做好准备。
4)在以磷酸钙作为转染介质的三质粒共转染HEK-293细胞的研究中发现，转染时细胞存活率、细胞结团大小、转染复合物大小及培养转速对悬浮转染效率有显著影响。优化后的悬浮转染工艺为：Ca2+150mmol/L、Mg2+100 mmol/L、PO43-1.5mmol/L以及质粒DNA 1.5μg DNA/ml-media(各质粒间的质量比为1：1：1)为转染复合物形成条件，并在转染前以2mmol/L的EGTA孵育HEK-293细胞30min，40rpm的转速条件下，CaPi-Mg-DNA转染复合物与HEK-293细胞转染6小时后，加入等体积的FSFM继续培养至收获细胞提取rAAV-LacZ病毒载体。最终在250ml的摇瓶中悬浮瞬时转染效率为50％，rAAV-LaeZ病毒载体的物理滴度为5.12×1011p.p./60ml·culture，转导滴度为1.51×1010L.F．U．/60ml·culture，病毒载体基因组含量为5.08×1010v．g．/60m1·culture。
5)在聚乙烯亚胺介导的三质粒共转染HEK-293细胞包装rAAV-LacZ病毒载体的实验中发现，PEI与质粒DNA结合比例、PEI-DNA复合物与转染细胞的比例、转染复合物的形成、转染时间、转染时培养转速以及转染时HEK-293细胞处于细胞周期G2/M时相的控制均可对转染效率及最终rAAV-LacZ病毒载体滴度产生影响。25kDa线状PEI(终浓度为30μg/ml)与三质粒DNA的使用比例为5：1(w/w)，在PBS(pH7-2)中形成PEI-DNA转染复合物；转染前4℃冷处理细胞1小时然后恢复至37℃继续生长18小时即可进行转染；PEI-DNA复合物于80rpm的条件下悬浮转染1×106cells/ml的HEK-293细胞，持续转染6个小时后，加入等体积的FSFM继续培养48小时至收获细胞提取rAAV-LacZ病毒载体。最终在250ml的摇瓶中悬浮瞬时转染的效率为75％，rAAV-LacZ病毒载体的物理滴度为7.57x 1011p.p./60ml·culture，转导滴度为2.86x 1010L.F．U．/60ml·culture，病毒载体基因组含量为8.03x1010V．g．/60ml·culture。与磷酸钙介导的悬浮转染比较，PEI介导结合4℃低温冷处理的悬浮瞬时转染可获得更高的单细胞病毒载体包装量，体现了较好的规模放大的潜力。
6)转染后HEK-293细胞的生长代谢与rAAV-LacZ病毒载体产量具有一定的相关性。研究结果表明，转染后确保HEK-293细胞继续生长有利于rAAV-LacZ病毒包装成熟，即转染后16.67mmol/L的葡萄糖和3mmol/L的谷氨酰胺可促使HEK-293细胞中包装的rAAV-LacZ病毒载体的滴度达到最大值，8.88×1010v．g．/60ml·culture。根据实验结果，模拟出HEK-293细胞胞内ATP含量及能荷水平与rAAV-LacZ病毒载体滴度的关系，发现当胞内ATP含量在2.05～5.15 fmol/cell，能荷水平小于0.86时，可以获得相对较高的rAAV-LacZ病毒滴度，大于5×1010v．g．/60ml·culture。 7)控制HEK-293细胞在5L动物细胞反应器中悬浮生长时细胞结团大小可对HEK-293细胞生长产生显著影响。研究结果表明，在5L动物细胞反应器中先以FSFM培养HEK-293细胞，培养2天后加入一定量的Ex-cellTM 293 SFM培养液可有效控制HEK-293细胞的结团直径在50～100μm之间，实现HEK-293细胞悬浮生长，细胞密度可达10×105cells/ml；并以PEI为转染介质介导三质粒共转染HEK-293细胞，结合转染前4℃胁迫处理细胞1小时以及转染后控制细胞生长状态，最终，获得病毒滴度5.79x1012v．g．/4L·culture。