论文部分内容阅读
普鲁兰酶是一类重要的淀粉脱支酶，能够专一性的水解支链淀粉和普鲁兰多糖的α-1，6糖苷键形成直链淀粉和麦芽三糖。普鲁兰酶能够与糖化酶或β-淀粉酶协同作用，能够达到提高葡萄糖或麦芽糖产量的目的。因此在高葡萄糖浆的生产中具有重要的应用，目前也是研究最多的。由于国内开发的大多数普鲁兰酶不能同时满足葡萄糖生产所需的耐热、耐酸，高催化效率的条件，商品普鲁兰酶也主要依赖于进口。因此，通过蛋白质改造工程获得具有耐热、耐酸和高催化效率的普鲁兰酶具有重要的意义。 本实验室前期从我国云南腾冲地区轮马热泉的淤泥中分离获得了一株耐热普鲁兰酶产生菌，该菌为Anoxybacillus属种，从中克隆了耐热普鲁兰酶的编码基因(Accession No.HQ844266)，酶学性质显示该酶的最大比活(Vmax)为750 U/mg;最适温度为60℃，最适pH为5.6-6.4;在60℃，处理48 h，还有50％的活性，但是为更好的在高温条件下与糖化酶协同作用，达到更好的糖化效果，该酶的热稳定性仍需进一步的提高。本文以Anoxybacillus sp.11-8来源的Ⅰ型普鲁兰酶（PulA）为研究对象，通过三种改造方法提高PulA的热稳定性包括氨基酸共义性方法和结构分析相结合的方法，截去蛋白结构中柔性比较大的氨基酸序列以及优化蛋白表面电荷的方法，对PulA分子结构进行了全面分析及热稳定性的定向改造。通过前两种方法最终获得了10个单点正向突变体(L623T、R473E、Y477A、 Y175C、L215P、Q31V、V91I、L103K、I70A、M294A)和1个截短突变体(residues686-688)，通过单点突变体和截短突变体的叠加获得9个正向突变叠加突变体，其中3个热稳定性提高程度最大的突变体M17(Y477A/D3/Y175C/L215P)，M18(Y477A/D3/Y175C/L215P/R473E)和M19(Y477A/D3/Y175C/L215P/R473E/L623T)的T50值分别为69.8℃，70.8℃和72℃，相比野生型PulA的T50值(66.8℃)分别提高了3℃，4℃和5.2℃。其中M18（Y477A/D3/Y175C/L215P/R473E）在60℃处理72 h后仍保留66％的残余酶活，而野生型PulA只有35％的残余酶活。在65℃处理4h，M18仍保留50.6％的残余酶活，而野生型只有16.8％的活性。突变体M17，M18，M19的Km分别是野生型PulA的0.7倍、1.8倍、3.9倍，而催化效率Km/Kcat分别是野生型的130％，80％，30％。通过氨基酸共义性和结构分析的方法得到的位于蛋白表面的热稳定性提高的相关位点，可能主要是通过减少蛋白表面的疏水面积或同时增加蛋白内部的作用力来提高PulA的热稳定性通过优化表面电荷的方法，得到突变体N527D，其热稳定性(T50)较野生型提高了1℃。 对野生型PulA和突变体M18在啤酒糖化过程中的应用效果进行了评价，同时与杰能科的商品普鲁兰酶(optimax L-1000)进行了效果对比。首先，构建了分别产两种普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600(PulA/pBE980B)，Bacillus subtilisWB600(M18/pBE980B)。产PulA和M18的重组工程菌株在10L的发酵罐中发酵60 h后，最大酶活分别达到425 U/mL和315 U/mL。重组普鲁兰酶PulA、M18和商品普鲁兰酶optimax L-1000在啤酒发酵的糖化过程中最适加酶量分别为250 mL/t、150 mL/t和250mL/t; M18可使原麦芽汁浓度最高达到13.54°P，PulA可使麦芽汁发酵度达到最高为71.1％;与optimax L-1000相比，PulA和M18催化得到麦芽糖比例相对较高，麦芽三糖比例相对较低，有利于提高啤酒的发酵度，在啤酒发酵工艺中显示了更好的应用前景。 通过序列比对和Propka计算相结合的方法，选择可能影响PulA作用pH的位点M278进行突变研究，获得的突变体M278K和M278D最适作用pH均为6.5，较野生型PulA的最适作用pH均提高了0.5个单位。可见，M278位点改变了活性中心位点附近的疏水环境和静电环境，可最终导致该酶的作用pH发生偏移。另外，突变体M278K和M278D的最适温度均降低为40℃，突变体M278K的比活为216 U/mg，突变体M278D的比活为55U/mg。可见，位点M278对PulA催化性质的影响是综合性的。 本论文还从新筛选的嗜热菌Anoxybacillus rupiensis中克隆到了一个Ⅰ型普鲁兰酶编码基因(PulAR)，与Amxybacillus sp.ATCC BAA-2555、Anoxybacillus tepidamans和Bacillus sp.2_A_57_CT2来源的Ⅰ型普鲁兰酶的氨基酸序列相似性最高，分别为79％，65％，61％，可见，该酶在序列上具有一定的新颖性。经酶学性质测定，该酶的最适作用温度为60℃，最适作用pH为6.5，在60℃处理18h后，仍保持50％的残余酶活，也是一个耐热性较好的Ⅰ型普鲁兰酶。动力学分析显示，PulAR的Km和Vmax值为分别为1.04 mg/mL和26.3 U/mg。EDTA、Mn2+和Co2+可强烈抑制其酶活性，K+、Mg2+、Ca2+和Li+对酶活没有显著影响。PulAR的最佳降解底物为普鲁兰糖，以降解普鲁兰糖的酶活为100％，其对可溶性淀粉、土豆支链淀粉、玉米支链淀粉、玉米淀粉的相对酶活分别是23％、31％、10％、9％，对糖原的水解作用为0.08％。成功构建了产PulAR的重组菌株Bacillus subtilis WB600(PulAR/pBE980B)，摇瓶发酵培养72 h后，发酵液酶活达到19U/mL。 本论文还通过序列比对和定点突变手段对PulAR进行了热稳定性的分子改造研究，得到两个突变体H499S和H499C，其T50值分别比野生型PulAR提高了2℃和1℃。突变体H499S和H499C的最适作用温度和pH分别为65℃和6.5。在65℃处理80 min后PulAR的残余活性仅有初始活性的4％，而突变体H499S和H499C仍保留71％和38％的残余酶活，H499S和H499C突变体蛋白质内部氢键的增加可能是其热稳定性提高的主要原因。酶促反应的动力学分析显示，H499S和H499C对底物的结合力和催化效率影响不大。