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胃癌(Gastric Cancer，GC)是最常见的消化道恶性肿瘤之一，严重危害全球人类的健康。近年来，尽管临床上胃癌的诊断和治疗已经取得了巨大的进展，但其发病率及死亡率在全世界范围内依旧位列所有肿瘤中的第四及第二位。流行病学研究表明，我国胃癌患者具有分期晚、复发率高和预后差等特点，总体治疗效果不佳，患者的5年生存率较低。因此，找寻新型有效的胃癌治疗策略刻不容缓。众所周知，胃癌的发生发展是一个多阶段、多因素渐进性积累的复杂过程，遗传、环境等多因素均参与其中。其中，遗传学以及表观遗传学的改变发挥着至关重要的作用。癌基因的异常活化以及抑癌基因的异常失活导致许多与细胞增殖、分化、周期和命运相关的重要信号通路的活性发生了改变，最终造成胃癌的发生。
CXXC指蛋白4(CXXC finger protein4，CXXC4)最早在肾细胞癌中作为经典Wnt信号通路的负向调控因子而引起研究者的广泛重视。CXXC4含有一个特殊的CXXC锌指结构域，大量研究证实该结构域可以与DNA结合并调控基因的转录表达。本课题组的前期研究发现CXXC4是一个新型的胃癌相关肿瘤抑制因子，其在胃癌组织中低表达，且其表达量与胃癌患者的预后成显著负相关。此外，发现CXXC4是组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶(enhancer of zeste homolog2，EZH2)的直接下游靶基因，起到负向调节Wnt/β-catenin和Ras/MAPK信号传导的作用，从而抑制胃癌细胞的生长。
生长分化因子15(Growth differentiation factor15，GDF15)是转化生长因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）超家族的成员之一，其广泛参与人体的众多病理生理过程，例如应激反应、骨形成、缺血再灌注损伤和癌症等。大量研究证据表明，GDF15同时具有促进和抑制肿瘤发生两方面的作用，且这种双向调控作用与不同的肿瘤类型、肿瘤细胞的状态、所处的阶段、肿瘤的微环境等密切相关。同时，有研究表明GDF15可以作为临床肿瘤治疗及预后评估的一个有效潜在分子标记物。
目的:
前期研究结果表明CXXC4能够有效抑制胃癌细胞增殖，发挥肿瘤抑制作用。CXXC4在胃癌组织中低表达且其低表达与胃癌患者的不良预后相关。本论文旨在进一步探索CXXC4抑制胃癌细胞增殖的具体分子调控机制，探究CXXC4是否通过其CXXC锌指结构域发挥该抑制作用，鉴定其下游潜在靶基因，以及探索两者之间的分子调控机制。另一方面，结合临床组织学样本和公共数据库分析该靶基因与胃癌的临床相关性。本论文希望通过阐明CXXC4抑制胃癌发生发展的具体分子调控机制，为CXXC4缺陷型胃癌患者的临床诊断、治疗以及预后判断提供一个新的有效潜在靶点。
方法:
首先构建强力霉素(Doxcycline)诱导稳定表达CXXC4的胃癌细胞株SGC7901-WT，通过MTS细胞存活实验、流式细胞术、western blot免疫印迹实验探索CXXC4高表达对于胃癌细胞的作用。通过胞浆胞核分离实验和免疫荧光实验确定CXXC4的细胞定位。运用酵母双杂交系统评估CXXC4野生型(WT)以及CXXC结构域突变型(MT)两者的DNA结合能力，同时通过MTS、流式细胞术、western blot实验探索CXXC4突变型对于胃癌细胞的作用。而后，通过比较Dox诱导CXXC4表达前后的mRNA表达谱芯片数据和凋亡相关基因集以及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)实验，鉴定出CXXC4下游的潜在靶基因GDF15。运用si-RNA技术敲低CXXC4后通过qRT-PCR和western blot分别在mRNA和蛋白水平验证GDF15的变化，进一步佐证。通过质粒转染、病毒感染和si-RNA技术模拟GDF15过表达及敲除的状态，采用流式细胞术、western blot、细胞平板克隆形成实验和MTS实验检测GDF15表达对于细胞凋亡的影响。通过免疫组织化学染色比较胃癌患者癌组织和癌旁组织中GDF15的表达差异，同时提取TCGA和Oncomine数据库中的胃癌患者数据进行分析，探索GDF15和胃癌的临床及预后相关性。最后，通过染色质免疫共沉淀(ChIP)实验、qRT-PCR和western blot实验探索CXXC4调控GDF15的分子机制。
结果:
发现新型胃癌相关抑制因子CXXC4在胃癌细胞中具有核定位，通过比较Dox诱导CXXC4表达前后的mRNA表达谱芯片数据和凋亡相关基因集，筛选并进一步证实CXXC4下游直接靶基因GDF15。CXXC4通过上调GDF15的转录表达，促进胃癌细胞的凋亡，抑制胃癌的发生发展;而CXXC结构域突变的CXXC4（CXXC4-MT）则丧失了转录调控GDF15表达的能力，不能引起胃癌细胞凋亡。具体而言，CXXC4可以通过增强转录因子Sp1对于GDF15启动子区域的结合能力实现对于GDF15的转录调控。胃癌患者的免疫组化分析以及公共数据库的生存预后分析发现，相较于胃癌组织，GDF15在癌旁组织中高表达，而且其高表达与胃癌患者更长的OS、DFS正相关。
结论:
本研究首次发现GDF15是CXXC4的下游靶基因，CXXC4可以通过增强转录因子Sp1对于GDF15启动子区域的结合能力促进GDF15的转录表达，诱导胃癌细胞凋亡，从而抑制胃癌的发生发展，而CXXC结构域突变的CXXC4则没有上述调控作用。GDF15在胃癌组织中相对低表达，其低表达与胃癌患者的不良预后相关。本论文基本明确了CXXC4和GDF15的抑癌作用及相关调控机制，为CXXC4缺陷型胃癌患者的防治提供了新的理论基础和可能的临床治疗与预后评估靶点。
CXXC指蛋白4(CXXC finger protein4，CXXC4)最早在肾细胞癌中作为经典Wnt信号通路的负向调控因子而引起研究者的广泛重视。CXXC4含有一个特殊的CXXC锌指结构域，大量研究证实该结构域可以与DNA结合并调控基因的转录表达。本课题组的前期研究发现CXXC4是一个新型的胃癌相关肿瘤抑制因子，其在胃癌组织中低表达，且其表达量与胃癌患者的预后成显著负相关。此外，发现CXXC4是组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶(enhancer of zeste homolog2，EZH2)的直接下游靶基因，起到负向调节Wnt/β-catenin和Ras/MAPK信号传导的作用，从而抑制胃癌细胞的生长。
生长分化因子15(Growth differentiation factor15，GDF15)是转化生长因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）超家族的成员之一，其广泛参与人体的众多病理生理过程，例如应激反应、骨形成、缺血再灌注损伤和癌症等。大量研究证据表明，GDF15同时具有促进和抑制肿瘤发生两方面的作用，且这种双向调控作用与不同的肿瘤类型、肿瘤细胞的状态、所处的阶段、肿瘤的微环境等密切相关。同时，有研究表明GDF15可以作为临床肿瘤治疗及预后评估的一个有效潜在分子标记物。
目的:
前期研究结果表明CXXC4能够有效抑制胃癌细胞增殖，发挥肿瘤抑制作用。CXXC4在胃癌组织中低表达且其低表达与胃癌患者的不良预后相关。本论文旨在进一步探索CXXC4抑制胃癌细胞增殖的具体分子调控机制，探究CXXC4是否通过其CXXC锌指结构域发挥该抑制作用，鉴定其下游潜在靶基因，以及探索两者之间的分子调控机制。另一方面，结合临床组织学样本和公共数据库分析该靶基因与胃癌的临床相关性。本论文希望通过阐明CXXC4抑制胃癌发生发展的具体分子调控机制，为CXXC4缺陷型胃癌患者的临床诊断、治疗以及预后判断提供一个新的有效潜在靶点。
方法:
首先构建强力霉素(Doxcycline)诱导稳定表达CXXC4的胃癌细胞株SGC7901-WT，通过MTS细胞存活实验、流式细胞术、western blot免疫印迹实验探索CXXC4高表达对于胃癌细胞的作用。通过胞浆胞核分离实验和免疫荧光实验确定CXXC4的细胞定位。运用酵母双杂交系统评估CXXC4野生型(WT)以及CXXC结构域突变型(MT)两者的DNA结合能力，同时通过MTS、流式细胞术、western blot实验探索CXXC4突变型对于胃癌细胞的作用。而后，通过比较Dox诱导CXXC4表达前后的mRNA表达谱芯片数据和凋亡相关基因集以及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)实验，鉴定出CXXC4下游的潜在靶基因GDF15。运用si-RNA技术敲低CXXC4后通过qRT-PCR和western blot分别在mRNA和蛋白水平验证GDF15的变化，进一步佐证。通过质粒转染、病毒感染和si-RNA技术模拟GDF15过表达及敲除的状态，采用流式细胞术、western blot、细胞平板克隆形成实验和MTS实验检测GDF15表达对于细胞凋亡的影响。通过免疫组织化学染色比较胃癌患者癌组织和癌旁组织中GDF15的表达差异，同时提取TCGA和Oncomine数据库中的胃癌患者数据进行分析，探索GDF15和胃癌的临床及预后相关性。最后，通过染色质免疫共沉淀(ChIP)实验、qRT-PCR和western blot实验探索CXXC4调控GDF15的分子机制。
结果:
发现新型胃癌相关抑制因子CXXC4在胃癌细胞中具有核定位，通过比较Dox诱导CXXC4表达前后的mRNA表达谱芯片数据和凋亡相关基因集，筛选并进一步证实CXXC4下游直接靶基因GDF15。CXXC4通过上调GDF15的转录表达，促进胃癌细胞的凋亡，抑制胃癌的发生发展;而CXXC结构域突变的CXXC4（CXXC4-MT）则丧失了转录调控GDF15表达的能力，不能引起胃癌细胞凋亡。具体而言，CXXC4可以通过增强转录因子Sp1对于GDF15启动子区域的结合能力实现对于GDF15的转录调控。胃癌患者的免疫组化分析以及公共数据库的生存预后分析发现，相较于胃癌组织，GDF15在癌旁组织中高表达，而且其高表达与胃癌患者更长的OS、DFS正相关。
结论:
本研究首次发现GDF15是CXXC4的下游靶基因，CXXC4可以通过增强转录因子Sp1对于GDF15启动子区域的结合能力促进GDF15的转录表达，诱导胃癌细胞凋亡，从而抑制胃癌的发生发展，而CXXC结构域突变的CXXC4则没有上述调控作用。GDF15在胃癌组织中相对低表达，其低表达与胃癌患者的不良预后相关。本论文基本明确了CXXC4和GDF15的抑癌作用及相关调控机制，为CXXC4缺陷型胃癌患者的防治提供了新的理论基础和可能的临床治疗与预后评估靶点。