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稻属(Oryza L.)属于禾本科稻族(Oryzeae Dumortier),包括两个栽培种和20多个野生种。药稻复合体是稻属中最大的一个复合体,包括B、C、E、BC和CD5个基因组,共10个种,广泛分布在亚洲、非洲、澳洲和中南美洲的热带地区。众多学者对该复合体进行了广泛深入的研究,为后续研究奠定了坚实的基础。然而,迄今为止,关于多倍体起源时间、扩散路线;多倍体形成后基因组的二倍化过程;重复基因在多倍体中的表达模式以及功能分化等诸多问题尚未揭示清楚。
本研究利用核基因序列重建了复合体内各物种的系统发育关系,并利用分子钟推断了它们的分歧时间;以基因组专一性序列为探针,研究了基因组加倍后的二倍化过程;利用cDNA-AFLP技术结合RT-PCR研究了重复基因在多倍体中的进化。主要研究结果如下:
1,稻属药稻复合体系统发育研究
利用两个含有C基因组特有插入片段的核基因(Starch Debranching Enzyme和Os02g0125000)重建了药稻复合体的系统发育关系。基于单个或合并数据的最大似然法和贝叶斯分析结果都显示:
(a)B、C、D三个基因组都是单源起源的,其中B与C基因组的关系最近,E基因组是复合体中最原始的类群。
(b)在三个C二倍体物种中,0.officinalis与0.rhizomatis关系最近,0。eichingeri是三个物种中最先分化出来的。
(c)三个BBCC多倍体是多次起源的,0.eichingeri是0.punctata(BBCC)的C基因组供体,0.officinalis是0.malampuzhaensis和0.minuta的C基因组供体。
(d)三个CCDD物种是单次起源的,0.officinalis(或者0.rhizomatis)是它们的C基因组供体。
(e)E基因组虽然与D基因组关系最近,但是它们之间存在明显的分化。
此外,本研究还发现基因组专一性插入片段不但可以方便地用于多倍体中部分同源基因的分离,降低PCR重组发生的概率,而且还能提供比内含子和外显子区更多的信息位点。
2,稻属药稻复合体多倍体基因组进化研究
大量研究发现,多倍化发生后往往伴随广泛而快速的基因组进化。我们采用三种不同的策略来研究多倍化后药稻复合体中多倍体基因组的变异:
(a)利用消减杂交分离C基因组专一性序列(相对于B基因组),根据这些序列设计专一性引物,通过PCR的方法检测这些基因组专一性序列在BBCC多倍体中的分布。
(b)以基因组专一性序列结合B和E的全基因DNA作为探针,利用多色荧光原位杂交技术研究多倍化后染色体的二倍化过程。
(c)利用消减杂交技术分离B基因组二倍体形成多倍体后丢失的基因组片段。
结果显示:
(a)BBCC多倍体形成后,来自B和C基因组的序列都没有发生明显的丢失。
(b)BBCC多倍体形成以后,基因组间发生了部分同源染色体易位,并且发生易位的染色体在不同物种中是不同的。
(c)C基因组在CCDD三个物种中经历了不同的进化历程,C基因组在0.alta和0.grandiglumis中发生了向D基因组的入侵,而在0.latifolia中未发现这一现象。
3,BBCC多倍体中亲本基因的表达模式研究
伴随着多倍体的产生,来自不同亲本的部分同源基因在多倍体中往往会发生不同程度的基因沉默。为了研究这种基因沉默在BBCC多倍体中发生频率,我们利用cDNA-AFLP技术分析了来自四倍体0.punctata的一千多条条带,发现其中有8.5%的条带缺失可能是由基因沉默所导致。对其中的22条回收测序发现这些基因拥有不同功能。随机抽取10个基因,比较它们在0.punctata、0。malampuzhaensis和0.minuta中的表达,结果显示亲本基因在这三个种中的沉默是随机发生的,与亲本来源以及形成时间无关。由于BBCC多倍体形成以后没有发生明显的序列丢失,所以导致基因沉默的主要因素可能是表观遗传效应。
4,药稻复合体物种分歧时间估计及生物地理学研究
药稻复合体物种由于其分布范围广、形成时间短,其当前地理格局的形成一直是一个广受关注的问题。在本研究中,我们利用贝叶斯方法计算了该复合体内主要物种的分歧时间,并结合物种当前的地理分布对其起源地点和可能的扩散路线进行了推测(主要是C基因组物种)。结果显示:药稻复合体与我们所选的外类群0.granulata,于13.6±3.6 Mya开始分化,而复合体的第一次分化始于7.9±1.6 Mya;B与C基因组分化时间为4.8 Mya,随后C基因组在很短的时间内分化(0.9-1.8Mya),形成三个二倍体物种;BBCC多倍体形成的时间为0.3-0.9Mya,CCDD多倍体形成时间较早,为0.7-0.9Mya。由于所有的C基因组物种在2百万年内才开始形成,远远小于大陆开始分裂的时间,所以C基因组物种目前的地理分布格局用长距离扩散来解释更为合理。