论文部分内容阅读
恶性肿瘤严重危害人类的生命健康,当传统的治疗方法如手术、化疗、放疗等,对很多中晚期肿瘤患者束手无策时,基因治疗显示出了很好的优势。腺病毒载体是目前基因治疗中最有前景的一种病毒载体。我们利用腺病毒为载体,并对其进行改造,使其只在肿瘤细胞中复制、增殖,而对正常细胞没有影响,同时携带治疗基因,随着病毒在肿瘤细胞中的复制,基因也能特异性的表达,起到双重治疗肿瘤的作用,即靶向基因-病毒治疗。
端粒酶是目前已知的最为广谱的肿瘤标志物之一,因此本研究中利用人端粒酶逆转录酶启动子(hTERTp)调控腺病毒E1A基因表达,构建了特异性增殖腺病毒载体pAdSU,并克隆了人纤溶酶原激活剂抑制剂2(PAI2)基因,将其插入pAdSU 构建了增殖型腺病毒穿梭载体pAdSu-PAI2。通过与腺病毒骨架质粒同源重组的方法获得腺病毒AdSu-PAI2。经PCR 鉴定病毒包装正确后感染细胞,Western blot 检测腺病毒AdSu-PAI2的E1A和PAI2基因的表达,结果显示病毒感染3d 后腺病毒的E1A基因在端粒酶阳性的细胞中有表达,而在端粒酶阴性的细胞中没有表达,PAI2基因的表达水平有明显的增强,证实了所构建的溶瘤腺病毒AdSu-PAI2 可靶向性地在肿瘤细胞中复制、增殖,对正常细胞没有明显影响,而且可以特异性的表达PAI2 蛋白。MTT 实验通过比较病毒对肝癌细胞株BEL-7402和BJ 成纤维细胞株杀伤作用,发现其对肿瘤细胞有较强的杀伤作用,而对正常细胞杀伤作用很弱,反映出了AdSu-PAI2的选择杀伤作用。划痕实验显示加入病毒的细胞迁移力较空白对照明显减慢,说明AdSu-PAI2 有抑制细胞迁移的作用。软琼脂集落形成实验结果显示感染病毒AdSu-PAI2 后克隆形成率明显减少,表明AdSu-PAI2能有效抑制细胞的增殖和迁移。综上所述我们构建的携带治疗基因的溶瘤病毒能够在肿瘤细胞中特异性增殖并表达所携带的治疗基因,对肿瘤的基因治疗有重要意义。