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第一部分VMAT2杂合小鼠(VMAT2 HT)随年龄增长表现出运动障碍及抑郁样行为目的评价VMAT2 HT小鼠不同年龄阶段运动和抑郁样行为。方法VMAT2 HT转基因小鼠由美国Emory大学Uhl GR教授提供,在华中科技大学同济医学院实验动物中心饲养繁殖。选取不同年龄阶段(2月、6月、15月、30月)的雄性VMAT2 HT和野生型小鼠(VMAT2 WT),评价其行为学表现及黑质纹状体系统酪氨酸羟化酶(TH)表达及DA和5-HT含量。具体地说,旷场和转棒实验评价运动能力,糖水偏好实验和悬尾实验评价抑郁样行为。免疫组化评价纹状体TH表达,高效液相色谱电化学法(HPLC-ECD)评价纹状体DA和5-HT含量。结果运动行为学评价实验中2月龄、6月龄、15月龄VMAT2 HT小鼠和VMAT2 WT小鼠5min内运动总距离和5min内在棒时间没有明显差异(P>0.05);30月龄时VMAT2HT小鼠运动总距离明显小于VMAT2 WT小鼠,在棒时间也明显短于VMAT2 WT小鼠。抑郁样行为评价实验中,2月龄VMAT2 HT小鼠和VMAT2 WT小鼠糖水消耗百分比和6min内不动时间没有明显差异,6月龄、15月龄、30月龄VMAT2 HT小鼠糖水消耗百分比明显小于VMAT2 WT小鼠,6min内不动时间明显长于VMAT2 WT小鼠,提示VMAT2 HT小鼠在这些年龄段表现出抑郁样行为。TH免疫组化表明2月龄、6月龄、15月龄VMAT2 HT小鼠纹状体TH表达与VMAT2 WT小鼠相比没有明显差异(P>0.05),30月龄VMAT2 HT小鼠纹状体TH表达明显少于VMAT2 WT小鼠(P<0.05)。与之一致,HPLC-ECD结果提示2月龄、6月龄、15月龄VMAT2 HT和VMAT2 WT小鼠纹状体DA和5-HT含量没有明显差异(P>0.05),30月龄VMAT2 HT小鼠纹状体DA和5-HT含量明显少于VMAT2 WT小鼠(P<0.05)。结论VMAT2 HT小鼠随年龄增长,6月龄时出现抑郁样行为并且持续到30月龄,运动能力受损则直到30月龄才出现。VMAT2 HT小鼠30月龄时纹状体TH表达明显减少,纹状体DA和5-HT含量也明显减少。第二部分VMAT2表达减少加重帕金森病MPTP模型小鼠抑郁样行为和嗅觉减退目的研究减少VMAT2表达联合外源性神经毒素MPTP对小鼠非运动症状如抑郁样行为和嗅觉功能的影响,探究黑质多巴胺系统以外嗅球、杏仁核、蓝斑组织病理和生化改变以及室管膜下区/嗅球系统神经再生的改变。方法非运动行为学及黑质多巴胺系统外结构的观察:(1)每组10只6月龄VMAT2半敲小鼠(VMAT2 HT)和野生型小鼠(VMAT2 WT)分别给予腹腔注射MPTP(30mg/Kg/天)或者同等体积的生理盐水,连续7天,制作帕金森病亚急性模型。第18到21天,进行行为学评估。旷场实验和转棒实验进行运动能力评估;糖水实验和悬尾实验评估抑郁样行为;埋藏食物小球实验评估嗅觉功能。行为学评估后处死小鼠进行下一步生化分析。TH Western blot和免疫组化法评价黑质纹状体多巴胺系统及黑质外结构(嗅球多巴胺间质神经元、杏仁核多巴胺能神经纤维、蓝斑TH阳性神经元)的损伤;高效液相色谱电化学法评价纹状体、嗅球多巴胺内容物及其代谢产物的变化。(2)探究室管膜下区/嗅球系统神经再生的变化:每组10只VMAT2 HT和VMAT2WT小鼠分别给予腹腔注射MPTP(30mg/Kg/天)或者同等体积的生理盐水,连续7天。在第9天给予各组小鼠腹腔注射Brdu(50mg/Kg),每天2次,连续5天。最后一次注射Brdu 24小时后处死小鼠,计数Brdu阳性神经元评价SVZ/OB系统细胞增殖能力。结果(1)行为学评定结果表明MPTP可以引起VMAT2 HT和VMAT2 WT小鼠运动能力受损和抑郁样行为,VMAT2 HT小鼠更明显;明显的嗅觉减退仅在VMAT2 HT小鼠给予MPTP后出现。(2)VMAT2表达减少表现出更强的黑质纹状体系统MPTP毒性。TH Western blot实验表明MPTP干预后,VMAT2 HT和VMAT2 WT小鼠TH表达均降低,VMAT2 HT小鼠更明显。黑质TH阳性神经元计数结果与Western blot一致。纹状体Western blot和免疫组化实验表明MPTP干预后TH表达在两种基因型小鼠中都明显下降,VMAT2 HT小鼠下降更明显。纹状体DA及其代谢产物HPLC检测提示MPTP引起两种基因型DA含量明显下降,VMAT2 HT小鼠相对于VMAT2 WT小鼠下降更明显(82%VS 67%)。(3)蓝斑Western blot表明给予MPTP注射后VMAT2WT小鼠TH蛋白轻微下降,而VMAT2 HT小鼠表达水平明显下降。免疫荧光蓝斑TH阳性神经元计数与Western blot一致。杏仁核TH免疫组化结果表明MPTP可以引起两种基因型小鼠TH表达减低,VMAT2 HT小鼠更明显。嗅球Western blot结果表明MPTP暴露后,VMAT2 WT小鼠TH蛋白稍下降,VMAT2 HT小鼠明显下降。嗅球TH阳性神经元计数也证实了Western blot结果。嗅球HPLC-ECD结果表明VMAT2HT小鼠嗅球DA含量MPTP干预后下降66%,VMAT2 WT则轻微下降。(4)MPTP引起VMAT2 WT和VMAT2 HT小鼠室管膜下区/嗅球神经再生减弱,这一结果在VAMT2 HT小鼠中更明显。结论减少VMAT2表达加重MPTP小鼠抑郁样行为和嗅觉障碍,并引起黑质外结构如蓝斑、杏仁核、嗅球更严重的损伤。同时,减少VMAT2表达也加重了MPTP小鼠引起的SVZ/OB系统神经再生障碍。第三部分DOPAL对多巴胺能神经细胞的毒性研究目的研究VMAT2 HT不同年龄段小鼠及MPTP暴露后小鼠纹状体DOPAL/DA的变化;DOPAL处理对多巴胺能神经细胞SH-SY5Y细胞活力、α-synuclein聚集及自噬信号通路的影响。方法(1)高效液相色谱分析电化学法(HPLC-ECD)检测VMAT2 HT小鼠和野生型小鼠(VMAT2 WT)不同月龄(2月,6月,15月,30月)纹状体DA代谢产物DOPAL、DA的含量;HPLC-ECD检测MPTP暴露后的6月龄VMAT2 WT和VMAT2HT小鼠纹状体DOPAL/DA的变化。(2)给予SH-SY5Y细胞不同浓度和不同干预时间的DOPAL处理,倒置显微镜观察细胞形态;CCK8测定细胞活力;Western blot及免疫荧光检测SH-SY5Y细胞α-synuclein聚集情况;Western blot检测自噬相关蛋白P62、Beclin 1、LC3水平变化。结果(1)2月龄、6月龄、15月龄VMAT2 HT小鼠DOPAL/DA稍高于VMAT2 WT小鼠(P>0.05),30月龄时,VMAT2 HT小鼠DOPAL/DA明显高于WT小鼠(P<0.05);MPTP暴露可以增加VMAT2 WT和VMAT2 HT小鼠DOPAL/DA,VMAT2 HT小鼠更明显。(2)SH-SY5Y细胞呈短梭形,胞浆饱满,分布均匀,核仁清晰。倒置显微镜显示DOPAL处理后SH-SY5Y细胞核固缩,变圆,染色质聚集;CCK8结果表明DOPAL可以引起SH-SY5Y细胞存活率减低,且具有剂量和时间依赖性;Western blot和免疫荧光结果证实DOPAL可以引起细胞内α-synclein聚集;Western blot结果显示当DOPAL浓度小于100μM时,LC3-II/LC3-I和P62在DOPAL干预后出现剂量依赖性升高。与之类似,Beclin 1和P62在DOPAL干预后24 h开始升高并持续到48 h。结论VMAT2 WT和VMAT2 HT小鼠DOPAL/DA含量均随年龄增长而增高,VMAT2HT小鼠更明显;MPTP暴露可使VMAT2 WT和HT小鼠DOPAL/DA含量增高,VMAT2 HT小鼠更明显;DOPAL可以引起SH-SY5Y细胞活力减低,α-synuclein聚集,自噬溶酶体途径可能参与其中。