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香蕉枯萎病是世界性的香蕉毁灭性病害,其病原菌为尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysprum f.sp.cubense,简称Foc),有4个生理小种。本研究系统地比较了来自国内外的Foc的全部4个生理小种共8个菌株在生化及分子特征方面的差异,取得了如下结果:
1.香蕉枯萎病菌不同生理小种细胞壁降解酶的比较研究以羧甲基纤维素钠(CMC)和果胶为诱导物,Foc在离体培养条件下可产生多聚半乳糖醛酸酶(PG)、纤维素酶(Cx)、果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、滤纸酶(FPA)等4种细胞壁降解酶:本研究测定了不同生理小种4种细胞壁降解酶的活性,结果显示:在所有生理小种中,酶活性强度依次为PG、PMG、Cx和FPA。4个生理小种8个菌株的PG酶活性差异不显著。在PMG和Cx酶活性水平上,4号小种整体最强,1号小种次之,两者这两酶的活性明显高于2号和3号小种。国外的1号和4号小种Cx酶活高于国内,而且差异显著。在FPA酶活性水平上,来自国内的1号小种酶活性较低,其它小种和菌株的酶活性差异不显著。以上结果表明,PMG和Cx酶活强弱与4号小种对Cawendish香蕉品系的致病力强弱呈正相关关系,而PG和FPA则这种关系不明显。
2.香蕉枯萎病菌不同生理小种酯酶同工酶和可溶性蛋白的比较研究酯酶同工酶电泳图谱显示:总体来说,4个小种之间的酶谱差异较大,同一小种的酶谱比较相似。但同一小种(1号小种)的不同菌株如来自澳大利亚的WG02菌株与来自中国的Z14,Z15菌株的差异较大,呈现出地域性分化现象;而所有的供试菌株均有Rf=0.884的酯酶同工酶条带。4个小种8个菌株的可溶性蛋白电泳图谱相对丰富,有8个Rf相同的条带,只在另外7个条带上表现出差异;同一小种的菌株的电泳图谱相似度高,但同一小种的不同菌株也有差异。上述两种技术为Foc小种的区分提供了新的方法。以酯酶同工酶和可溶性蛋白电泳酶谱分别构建的聚类分析树状图是完全一致的,大部分致病力相近的菌株在同一分枝上,亲缘关系较近(WG05除外),一定程度上说明了两者是影响Foc不同小种对Cawendish香蕉品系致病性差异的因素之一。
3.香蕉枯萎病菌不同生理小种ITS-RFLP比较研究本研究克隆了香蕉枯萎病菌4个生理小种的ITS序列,8个菌株均得到568bp的片段。序列比对结果表明,它们的相似性达99.85％;8个菌株只在第342、389和408个碱基处存在差异。除4号小种的WG05菌株外,1号和4号小种的ITS序列相同;而2号和3号小种的ITS序列则完全相同。同源性比对结果表明,本研究4个小种8个菌株的ITS序列与GenBank中所登陆的尖孢镰刀菌(F.oxysporum)有着97%～100%的同源性,说明ITS序列不适合作为区分小种的依据。
采用3种限制性内切酶(AluⅠ、HpaⅡ、TaqⅠ),对4个小种8个菌株的ITS序列进行ITS-RFLP分析,结果表明,不同小种、不同菌株均得到了相同的酶切图谱,再次证实了4个小种ITS序列的保守性。
4.香蕉枯萎病菌不同生理小种endo-PG酶基因的比较研究基因克隆和测序结果显示,Foc的4个小种8个菌株均得到了2100 bp左右的内切多聚半乳糖醛酸酶(endo-PG)基因序列。Endo-PG序列比对结果表明,4个小种8个菌株该基因序列的相似性达到98.88%。总体来说,同一小种同源性高,不同生理小种的同源性较低;不同菌株endo-PG基因序列的亲缘关系图谱显示,不同菌株对Cawendish香蕉品系的致病力与其endo-PG基因序列同源性密切相关;对Cawendish香蕉品系不同致病力的菌株间遗传性状出现分化,证明endo-PG是4号小种对Cawendish香蕉品系的重要致病因子;8个菌株与近缘真菌endo-PG的亲缘关系树状图表明,除1号小种的WG02菌株外,同一小种菌株的亲缘关系很近,并各自聚集成一枝,为Foc小种的区分和致病力分化提供了又一依据。