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表观遗传调控在肿瘤发生发展中的作用近年来受关注热度不减，而且随着新技术的拓展和新思路的支撑，新功能新机制不断得到挖掘和阐明。组蛋白甲基转移酶在肿瘤研究中日益受到关注，研究已证实多种肿瘤中存在有组蛋白甲基转移酶表达的异常或活性的异常，如组蛋白H3K9甲基转移酶G9a，H3K27甲基转移酶EZH2等，它们在多种肿瘤中均有显著高表达，因此被视为抗肿瘤治疗的可能新靶点而被广泛研究并有相应抑制剂的研发火热开展。但是这些异常调控的组蛋白甲基转移酶在肿瘤发生发展中的确切作用并未被明确揭示，特别是其具体的分子调控机制，这显然影响了对其作为抗肿瘤药物靶点的评判，也阻碍了相应抑制剂的研发和临床使用。本论文以两个重要的组蛋白甲基转移酶G9a和EZH2为重点研究对象，基于我们前期的研究基础，发现这两者在乳腺癌中均有显著高表达，因此我们希望通过本研究考察它们在乳腺癌发生发展中的作用及相应机制。 铁离子作为机体不可或缺的一种元素，常以辅基的形式存在于多种生命活动相关的酶中，影响细胞DNA生物合成和线粒体能量代谢。已有研究表明铁离子可调控细胞的氧化还原状态，铁稳态的破坏如铁过载可导致游离铁含量升高，不仅影响正常细胞的生长，更能促进肿瘤细胞增殖、改变肿瘤微环境、促进肿瘤转移、与病人不良预后相关等等，在肿瘤的发生发展中起重要作用。体内铁稳态的维持显然是一个精细的过程，目前与铁吸收、储存和转运相关蛋白的调控机制正逐步得到阐明，这些蛋白表达与功能的改变直接影响体内铁稳态的维持，最终可能引起肿瘤和其它疾病的发生。因此，通过调节铁离子的吸收、转运、储存来影响肿瘤细胞的生长和转移，监测铁含量的变化指征病人对化疗药的敏感性，可能会成为肿瘤诊断和治疗的新策略。本研究以铁稳态的变化为切入点，讨论组蛋白甲基转移酶G9a和EZH2促进乳腺癌的发展的具体机制。 1.G9a调控亚铁氧化酶Hephaestin(HEPH)表达促进乳腺癌生长 已有文献报道组蛋白H3K9甲基转移酶G9a在多种肿瘤中尤其是乳腺癌中显著高表达，对其作用及机制也有一些相应研究，但仍未有清晰阐明。我们首先通过构建G9a稳定干扰细胞株和高表达细胞株，在体内外均证实G9a能显著促进乳腺癌生长。基因芯片的结果则提示G9a能负调控铁稳态的重要调控蛋白之一亚铁氧化酶Hephaestin(HEPH)的表达。HEPH被认为是维持铁稳态的重要成员，已明确的该蛋白的主要作用是将二价铁氧化为三价铁，随后与铁转运蛋白Ferroportin(FPN)协同作用使铁离子输出细胞。我们的研究发现稳定干扰G9a或用G9a抑制剂处理的乳腺癌细胞株中，HEPH的mRNA水平和蛋白水平均显著上调，且细胞内亚铁离子含量明显降低，表明G9a抑制HEPH的表达从而破坏细胞内铁稳态。为进一步探索其中的分子调控机制，我们利用染色体免疫共沉淀(CHIP)、双荧光素酶报告基因启动子活性分析、免疫共沉淀(co-IP)等方法，证实G9a、去乙酰化酶HDAC1和转录因子YY1形成复合物，共同结合于HEPH的启动子区，协同G9a发挥组蛋白甲基转移酶活性，减少启动子区相应H3K9甲基化的发生，从而抑制HEPH的转录和表达。虽然HEPH被认为是铁稳态的重要成员，但其在乳腺癌中的作用未见任何报道。我们采用siRNA干扰等方法证实低表达HEPH确实可上调细胞内铁含量，促进乳腺癌的生长。补充外源铁或高表达HEPH能增加细胞内铁离子含量，部分回复由干扰G9a导致的乳腺癌细胞生长抑制、细胞周期阻滞和细胞凋亡等作用，以上数据表明G9a促进乳腺癌发生发展的作用一定程度上是通过调控HEPH影响铁稳态来实现的。 更为重要的是，通过Oncomine、TCGA和KM-plotter数据库的查询及乳腺癌病人的组织芯片染色分析，我们发现HEPH的表达与病人不良预后相关。我们不仅在乳腺癌细胞株中发现G9a与HEPH表达有一定负相关，在乳腺癌病人的肿瘤组织中我们也发现HEPH的表达与G9a显著负相关，且低表达HEPH同时高表达G9a的乳腺癌病人的生存期有更为明显缩短，预后相对更差。 综上，我们的研究证实G9a可以促进乳腺癌细胞的体内外生长，阐释了G9a通过影响肿瘤细胞内的铁稳态促进乳腺癌生长这一全新机制。此外，我们的研究结果也为铁稳态改变可促进乳腺癌发展提供了切实的实验依据，并首次证实HEPH在乳腺癌发展中的重要功能。这些结果表明G9a和HEPH均有望成为乳腺癌的新的治疗靶点或提示肿瘤预后进展的生物标志物，为乳腺癌患者寻找新的治疗方案提供依据。 2.EZH2细胞背景依赖性影响乳腺癌细胞铁稳态促进其发展 第一部分的研究已明确铁稳态的异常与乳腺癌的发生发展密切相关，而G9a可以通过抑制HEPH的表达，影响乳腺癌的铁稳态，从而促进乳腺癌的发生发展。G9a之外，是否还有其它的组蛋白甲基转移酶也参与对铁代谢的调控呢？为此我们进一步考查了另一个在近期研究中受到热捧的明星组蛋白甲基转移酶EZH2，考察其是否也可以调控乳腺癌的铁稳态，最终影响乳腺癌的发生发展。虽然已有文献表明EZH2在不同分子分型的乳腺癌中都有异常表达，但我们的研究发现干扰或抑制EZH2对不同分子分型的乳腺癌细胞的铁稳态、细胞生长的作用却并不一致。在ER+的乳腺癌细胞中，干扰或抑制EZH2上调ER+细胞的铁含量，且不抑制细胞生长;而在ER-细胞，抑制EZH2表达或活性则可下调乳腺癌细胞内的铁含量，且明显抑制细胞的生长和侵袭转移。进一步研究发现EZH2这一作用可能是通过调控转铁蛋白受体TfR-1（transferrin receptor-1）的表达来实现的。 TfR-1是细胞吸收铁的关键分子，在多种肿瘤如慢性淋巴细胞性白血病、乳腺癌、膀胱移行细胞癌、神经胶质瘤和肺癌中高表达，且上调的程度和肿瘤的分级、分期及病人预后相关。有数据库及基因芯片分析表明干扰EZH2可影响TfR-1表达。我们对Oncomine的临床乳腺癌患者样本数据库挖掘分析显示TfR-1与EZH2在乳腺癌中正相关表达。这些结果提示TfR-1与EZH2在乳腺癌的诊断和治疗中可能发挥着十分重要的作用，但是两者在乳腺癌中的具体作用及两者的关联并未有研究明确，因此我们进行了进一步探索。我们采用siRNA干扰和EZH2特异性抑制剂处理14株乳腺癌细胞，发现EZH2对TfR-1的表达确实有影响，但这一作用与干扰EZH2影响乳腺癌细胞生长一样，在不同分子分型的乳腺癌中表现完全不同。在ER+乳腺癌细胞中干扰EZH2表达后，相应地TfR-1表达则明显上调，而在ER-乳腺癌中EZH2作用则完全相反，干扰EZH2抑制TfR-1的表达，进而引起与铁含量的改变。已有研究结果表明EZH2可影响NF-κB活性，调控其下游基因的表达。也有文献报道NF-κB的刺激因子TNF-α可上调TfR-1的表达。这些结果提示EZH2对TfR-1表达的调控是否可能依赖于NF-κB的参与。于是我们在ER-细胞中瞬时干扰或过表达NF-κB的亚基，检测TfR-1表达和启动子活性的改变，结果证实TfR-1确实是NF-κB的靶基因。进一步对其启动子分析并实验证实转录因子AP-1也参与对TfR-1的表达调控。随后，CHIP、双荧光素酶报告基因启动子活性分析和co-IP等实验结果则表明，EZH2以其非酶活功能与AP-1和NF-κB相互作用共同促进了靶基因TfR-1的转录。而另一方面，ER+细胞中EZH2依赖传统的组蛋白甲基转移酶活性与ERa协同抑制TfR-1的表达。最后，我们利用CRISPR/Cas9技术敲除乳腺癌细胞TfR-1，发现其显著影响细胞体内外的生长和克隆形成能力，阻碍体内外的侵袭转移。而在ER-细胞里高表达TfR-1则可以部分回复由干扰EZH2引起的细胞增殖抑制和迁移能力减弱等效应，再次证实EZH2促进乳腺癌细胞生长和转移的功能部分是通过调控TfR-1的表达发挥的。 铁代谢与肿瘤发生发展的相关性的研究在近年受到关注，但仍缺乏明确的结论。影响铁稳态、铁代谢的因子、蛋白很多，其机制精密而复杂，很多通路之间的联系并未被阐明，且研究方法和检测手段均不够成熟，因此该领域的研究在存在较大探索空间的同时也存在很多的挑战。而表观遗传对铁稳态的调控更是知之甚少。本论文以乳腺癌为研究重点，一方面从铁输出的角度讨论了H3K9甲基转移酶G9a对亚铁氧化酶HEPH的抑制作用，一方面从铁吸收的角度讨论了H3K27甲基转移酶EZH2对转铁蛋白受体TfR-1细胞背景依赖性的调控作用，显示表观遗传对铁稳态调控的全方位参与。此外，我们对两个铁代谢相关蛋白（HEPH和TfR-1）的表达在乳腺癌生长中的作用及其与临床病人生存期和预后的相关性进行了分析和探讨，初步明确了它们在乳腺癌发生发展中的作用，为乳腺癌的诊断和治疗提供了新的可能。随后，我们还将进一步探索组蛋白甲基转移酶抑制剂与铁离子螯合剂联用的可能性，期待为乳腺癌治疗提供新的手段。