水稻成熟及萌发花粉细胞质膜的定量蛋白质组学研究

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在开花植物的有性生殖过程中,发育成熟的花粉借助于风媒或虫媒被传粉至雌蕊的柱头,亲和的花粉在柱头上复水、萌发产生极性生长的花粉管,通过花粉管将两个精细胞运送至胚囊,启动双受精。此过程涉及花粉以及花粉管与雌蕊细胞的相互识别与互作。质膜蛋白执行细胞内外物质交换、细胞识别与免疫应答、信号传导和调控,以及能量传递等重要功能,在花粉及花粉管与雌性细胞的识别与互作过程中起着关键作用。因此,系统解析花粉与花粉管质膜蛋白质以及成熟与萌发花粉质膜蛋白的差异,对于进一步研究花粉与柱头的识别及花粉管极性生长的机制是十分重要的。本论文以水稻成熟和萌发花粉为材料,建立了适合大规模分离纯化花粉质膜的技术方法,分离纯化了成熟和萌发花粉的质膜,利用iTRAQ定量蛋白质组方法定性与定量解析了成熟与萌发花粉的质膜蛋白。在鉴定的1979个蛋白(1631个unique蛋白)中,1121个蛋白(899个unique蛋白)有预测的跨膜区或脂锚定结构域,也具有细胞质膜相关的亚细胞定位信息,是质膜相关蛋白。这些质膜相关蛋白主要涉及信号转导(25%)、离子运输(19%)、细胞壁代谢(12%)、囊泡运输(11%)以及细胞骨架动态(5%)等生物学过程。192个质膜相关蛋白(192个unique蛋白)在花粉萌发前后的丰度显著变化,其中119个在萌发花粉中上调,73个在萌发花粉中下调。这些上调的蛋白主要包含了信号转导蛋白、糖与磷脂运输通道蛋白,如:钙依赖蛋白激酶、生长素信号蛋白、磷脂酰肌醇激酶、磷脂酶D、CrRLK1L型类受体激酶、单糖运输通道,以及磷脂运输通道;而下调的蛋白主要包含一些离子运输通道,如H+反向运输通道和Mg2+通道等。  利用实验室前期鉴定的5939个在成熟花粉、5945个在萌发花粉中表达的基因信息,我们分析了这899个unique质膜相关蛋白的转录本信息。结果显示58.4%的蛋白(525个)有相应的转录本信息。与水稻根、叶及愈伤组织转录本的表达水平相比,水稻成熟与萌发花粉平均有44%的转录本是优势表达的,而质膜相关蛋白所对应转录本有60%(317/525)是成熟或萌发花粉优势表达的,提示出质膜相关蛋白的基因比其他基因有更强的组织特异性。在525个有转录本信息的质膜相关蛋白中,500个有iTRAQ定量信息(萌发/成熟),比较他们的iTRAQ定量信息及其相应转录本的定量信息发现二者总体上的相关系数为-0.1631,表明质膜相关蛋白基因的转录水平与蛋白丰度之间缺乏相关性。  类受体激酶(PRKs)是细胞内外信号转导通路的核心组分,在花粉与柱头的识别、花粉管的极性生长、花粉管在花柱内的导向以及花粉管适时破裂释放精细胞等过程中起重要调控作用。根据保守结构域的比对分析,我们在鉴定的花粉质膜相关蛋白中发现了32个类受体激酶,它们隶属于CrRLK1L、Extensin、LRR、PERK、RLCK、SD、URK以及not_assigned八个亚家族。同时,我们的数据包含了“PRKs-GEF-Rac/Rop”信号转导途径的所有关键蛋白,表明该信号通路在花粉与柱头相互作用以及花粉管极性生长等过程中有重要作用。
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