【摘 要】
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重组工程(Red/ET,recombinationmediatedgeneticengineering)是指由重组酶催化的DNA短片段之间的同源重组而在大肠杆菌中进行基因克隆或改造的一种技术。重组工程可以在基因
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重组工程(Red/ET,recombinationmediatedgeneticengineering)是指由重组酶催化的DNA短片段之间的同源重组而在大肠杆菌中进行基因克隆或改造的一种技术。重组工程可以在基因片段的任意位点进行准确的敲入、敲除、置换,并且不受酶切位点的限制,现已逐渐成为常规的克隆手段。
重组工程中的重组酶主要是来源自λ噬菌体三个基因,其中redα(exo)编码DNA5端至3端的外切酶,其作用于双链DNA分子而产生3端突出的分子;redβ(bet)编码单链结合蛋白,其结合在DNA分子的3突出端,还具有重组酶活性,促进两个单链、同源DNA分子之间的退火产生重组DNA;redy(gam)基因的作用是抑制大肠杆菌RecBCD对外源DNA的降解。
目前主要应用的两种重组工程系统都是基于red基因构建的。第一种系统是前噬菌体系统,以美国国立癌症研究所DonaldCourt实验室构建的大肠杆菌DY380为代表。是将缺陷九前噬菌体整合至大肠杆菌基因组中构建而成,重组酶基因由P1启动子所诱导。
在DY380中,red基因由PL启动子严格调控,30℃时,PL启动子被温度敏感性抑制子cI857抑制,42℃时抑制解除。因此在DY380中,重组酶的表达是由30℃转移至42℃时的温度升高所诱导的。此系统的缺点是菌株需要在30℃生长,比在37℃下生长要慢;其次,重组酶的表达需要42℃水浴进行15分钟精确的热诱导。
第二种是基于质粒的重组酶系统,最常使用的两个质粒是pKD46(氨苄青霉素抗性)和pSC101-BAD-gbaA(四环素抗性)载体。在这两个质粒中,red基因都是由pBAD启动子所驱动,pBAD启动子受L-阿拉伯糖诱导表达的araC基因所激活;质粒的复制子都是温度敏感型复制子,在30℃才能行使复制功能,菌株需要在30℃培养。
为了给重组工程提供更多的酶系统,本论文中我们构建了新的重组工程菌株和载体。通过将重组酶基因整合至大肠杆菌的基因组中构建了一个新的重组工程菌株大肠杆菌LS-GR。LS-GR在37℃生长,red基因受L-阿拉伯糖诱导表达。通过将含有p15A骨架的中等拷贝载体pACYC184和单拷贝的pECBAC1抗性标记基因替换进行验证其重组功能,这两个载体都是在分子克隆研究中经常用到的。结果表明以本菌株进行重组工程的操作简便,重组效率高,可成为通用的重组工程用菌株。
新的重组酶质粒系统的构建是通过两种方式:第一种是在pKD46orf60a基因后面分别克隆orf63或orf63和orf61基因。另一种是通过在red基因中引入定点突变的方式。通过对pECBAC1上面抗性基因的替换来验证新构建重组系统的功能,最后证明pLS502的重组效率是pKD46的2倍。
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