论文部分内容阅读
疟疾是疟原虫（Plasmodium spp.）感染导致的蚊媒传染性疾病，疟原虫生活周期复杂，经历了多宿主和多细胞形态的转化，每一步都需要精确地基因时空表达调控，转录因子介导的DNA转录水平的调控起到重要作用。 ApiAP2基因家族是疟原虫基因组中预测的为数极少的转录因子基因家族，在人疟原虫和啮齿类动物疟原虫中高度保守。在顶复体亚门生物（包括疟原虫）和植物中，ApiAP2基因编码蛋白均含有一个或者多个60个氨基酸大小的AP2DNA结合结构域，起到激活或抑制转录的作用。 之前的转录谱和蛋白质组学分析发现，ApiAP2基因家族的多个成员在疟原虫生活周期中的不同阶段表达。因此，作为转录因子，ApiAP2可能贯穿整个疟原虫的生活周期并发挥精确的调控作用。迄今为止，ApiAP2基因家族的多数基因的功能是未知的，这些成员在疟原虫发育的不同阶段如何调控基因转录也尚未见报道。 本课题选择约氏疟原虫17XNL作为模型，构建ApiAP2家族26个AP2基因的单基因敲除载体，利用CRISPR/Cas9基因修饰技术获得单基因敲除虫株。通过电击转染加药筛选敲除型虫株，经多次转染和DNA水平PCR鉴定，共有18个AP2基因能够被敲除，并通过稀释法获得了18个能够被敲除的AP2基因的单克隆虫株。8个AP2基因在红细胞期不能被敲除，表明这8个基因对于疟原虫红期发育起重要作用。 本研究选择了两个成员基因AP2-1和AP2-7，对其单基因敲除单克隆虫株进行了完整生活周期表型的定量分析。 结果表明，AP2-1敲除型虫株在无性增殖阶段的红细胞期发育正常，雌雄配子体产生的数量均在正常范围内，配子体被按蚊吸食后在按蚊中肠内正常发育。AP2-1敲除型虫株血饲后8天卵囊数量与野生型相比没有差异，但是血饲15天后无唾液腺子孢子产生。进一步分析显示缺陷出现在卵囊发育阶段，AP2-1敲除型虫株产生卵囊子孢子的能力缺失，共聚焦显微镜观察11天和13天的卵囊子孢子，AP2-1敲除型虫株均无明显可见的卵囊子孢子产生。蛋白水平检测CSP表达，western blot结果显示在卵囊中早期发育过程中CSP不受AP2-1影响，正常表达。这些结果表明AP2-1调控疟原虫蚊期卵囊的发育。 AP2-7被敲除后红细胞期疟原虫正常增殖，雌雄配子体发育正常，雌雄配子体被按蚊摄入体内后能够正常受精，发育形成卵囊。与野生型相比，血饲后8天AP2-7敲除型虫株卵囊数量正常，但血饲15天后解剖唾液腺发现AP2-7敲除型虫株不能产生唾液腺子孢子。进一步研究表明AP2-7敲除型虫株卵囊子孢子的数量与野生型相比没有差异，共聚焦显微镜观察11天的卵囊子孢子也正常。这些结果表明AP2-7调控子孢子的发育。 本研究共获得18个在红期能够被敲除的AP2基因，进一步获得单基因敲除的单克隆虫株，初步揭示了ApiAP2基因家族2个成员的生理功能，为构建疟原虫生活周期的转录表达调控网络奠定基础，也为疟疾的防控提供新思路和新方向。