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目的：在分子生物学和遗传学中,转录因子(transcription factor TF)是一类可以和DNA序列特异结合的蛋白质,控制着遗传信息从DNA到RNA转录的过程。转录因子以单独形式或者与其他蛋白形成复合物的形式通过启动或者抑制RNA聚合酶来调控转录,包含一个或者多个DNA结合区域,可以和其调控的基因的DNA序列结合。转录因子从功能上可将转录因子分为两类,即普遍性转录因子和激活转录因子。普遍性转录因子是转录起始复合物组成成员,主要功能是将RNA聚合酶定位在核心启动子上,为启动子起始转录所必需。激活转录因子可影响转录起始复合物的组装及转录效率,决定某一基因是否表达。它们在真核生物基因的转录调控中占有十分重要的地位,是基因表达调控的核心内容之一。Fankl(fibronectin typeⅢ and ankyrin repeat domains1)是一个睾丸特异表达基因,编码一种核蛋白,在精子发生过程的减数分裂到单倍体阶段广泛表达,相关实验表明该蛋白为睾丸组织特异TF。前期研究中我们已经运用CAST实验筛选得到与Fankl特异结合的DNA靶点。本研究中通过基因芯片分析得到差异表达基因,进行聚类分析,相互作用分析,找出与Fankl相互作用的一组基因,为进一步找出Fankl的信号通路奠定基础。对该基因的深入研究可能会有助于对精子发生及调控机制的深入了解,从而对揭示精子发生的精细调节起到关键性作用。
方法：通过基因芯片分析Fank/Knockdown(KD)小鼠与同窝阴性小鼠,获得差异表达的基因。生物信息学网站和软件对差异表达基因进行聚类分析,相互作用分析,找出与Fankl相互作用的网络。把差异表达基因启动子与我们前期实验得到的与Fankl TF特异结合的DNA核心序列进行比对,从而得到受Fankl调控的下游基因。我们从中挑选出感兴趣的基因,在细胞水平,构建一个Fankl表达质粒转染293T细胞,检测目的基因表达变化,验证目的基因和Fankl的相互作用;在动物水平,通过检测KD小鼠和同窝阴性小鼠睾丸组织目的基因表达差异,验证芯片结果;通过检测KD小鼠和同窝阴性小鼠心、肝、肺、肾、睾丸组织中目的基因的表达,验证差异表达是否发生在睾丸组织中。
结果：
1、芯片分析得到差异表达的基因355个,其中上调243个,下调112个。在这些数据中,差异趋势一致的有25个,其中上调16个,下调9个。
2、差异趋势一致的差异表达基因中有10个基因的启动子中含有CAST得到的与Fankl转录因子特异结合的核心序列(AAAAAG)。
3、RT-PCR实验验证差异表达基因,并且验证差异表达基因仅发生在睾丸组织中,与转基因整合位点无关。
4、通过293T细胞转染Fankl表达质粒,证明Fankl对Duspl存在调控作用。
结论：
1、应用芯片分析得出可能受Fankl调控的下游基因,为进一步探究Fankl转录调控机制奠定基础。
2、细胞水平转染实验证明转录因子Fankl对Duspl存在调控作用。