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肝纤维化(hepatic fibrosis, HF)是各种不同致病因子引起慢性肝病进而发展为肝硬化的共有病理改变和必经途径,是肝脏对各种慢性损伤产生的一种修复反应。其主要病理改变是细胞外间质(extracellular matrix, ECM)的过度合成与异常沉积。肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)是肝脏主要的纤维生成细胞,其活化后可在肝损伤部位移行、增殖,表达各种信号转导蛋白,产生大量以胶原为主的ECM成分和细胞因子,是肝纤维化形成的中心环节。随着对肝纤维化发病机制的深入研究,如何抑制HSC活化、增殖,进而减少ECM合成,已成为目前阻断甚至逆转肝纤维化的重要策略。第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome Ten, PTEN)是迄今发现的第一个具有磷酸酶活性的肿瘤抑制基因,可负性调控肿瘤细胞细胞周期、抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡,其缺失或表达异常与多种肿瘤的发生发展密切相关。近年来,对PTEN的研究已从肿瘤领域逐渐延伸到非肿瘤领域。研究发现,特异性肝细胞PTEN缺失不仅引起肝细胞癌,还导致与肝纤维化密切相关的非酒精性肝炎的发生。而我们的前期研究表明,在胆总管结扎肝纤维化大鼠肝组织中PTEN蛋白及mRNA表达均低于正常大鼠肝组织并与在体HSC的活化、增殖呈显著负相关;进一步研究发现,过表达的PTEN可显著抑制体外活化HSC的增殖、诱导其凋亡,并且PTEN过表达可通过下调活化HSC的cyclinD1、CDK4蛋白及其mRNA表达,上调P27kip1蛋白及其mRNA表达负性调控活化HSC的细胞周期进程。但PTEN低表达对体外活化HSC细胞周期的影响仍不清楚。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是目前最有效的基因沉默技术,能特异性抑制靶基因的转录,进而下调相应蛋白水平及功能。为此,我们在前期研究的基础上,构建了靶向PTEN的RNA干扰重组腺病毒(Ad-siRNA/PTEN),并在体外感染活化的大鼠肝星状细胞系HSC-T6,观察阻断PTEN表达对活化HSC细胞周期的影响,从反面探讨PTEN在调控HSC生物学行为中的作用,以期从细胞周期角度揭示PTEN调控HSC增殖的机制,从而为寻找抗肝纤维化治疗的有效新靶点提供实验及理论依据。目的:采用RNAi技术,以腺病毒为载体,构建靶向PTEN的RNA干扰重组体,观察阻断PTEN表达对活化HSC细胞周期的影响及其信号转导机制。方法:利用AD293T细胞扩增实验所需的腺病毒(Ad-SiRNA/PTEN、Ad-EGFP),荧光显微镜检测病毒滴度,并在体外感染活化的大鼠肝星状细胞系HSC-T6。实验分组如下:①Control组,仅以含8%胎牛血清的DMEM细胞培养液培养细胞,在转染步骤加入无血清无抗生素DMEM代替病毒液;②Ad-EGFP组,转染表达增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)的空病毒Ad-EGFP;③Ad-siRNA/PTEN组,转染靶向PTEN的RNA干扰序列并表达EGFP的重组腺病毒Ad-siRNA/PTEN。流式细胞术测定HSC细胞周期时相;Western blot检测HSC的PTEN、细胞周期素D1(cyclinD1)、细胞周期素依赖性激酶4(cyclin dependent kinase4, CDK4)、细胞周期素依赖性激酶抑制因子(cyclin dependent kinase inhibitor, CDI)之一的P27kip1、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶B(serine-threonine protein kinase B, Akt)、p-Akt(Thr308)、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)及p-ERK蛋白表达情况。结果:①通过反复感染AD293T细胞的方法使病毒扩增获得了实验所需的病毒液(Ad-siRNA/PTEN、Ad-EGFP的滴度分别为1.1×109 pfu/mL、1.2×109 pfu/mL)。②腺病毒感染HSC后,应用Western blot分析随感染时间延长,HSC内PTEN蛋白的动态表达,结果显示,在0 h、24 h、48 h及72 h时,细胞内PTEN蛋白表达分别为2.46±0.06、1.78±0.04、1.43±0.12及0.79±0.14 (P<0.01)。在感染后72 h,同Ad-EGFP组(1.18±0.05)相比,Ad-siRNA/PTEN组(0.43±0.02)PTEN蛋白表达显著降低, P<0.01;而Control组(1.23±0.17)与Ad-EGFP组之间无明显差异(P>0.05)。③流式细胞仪检测结果显示,HSC细胞数G0/G1期所占比例,Ad-siRNA/PTEN组(57.70%±4.37%)较Control组(68.13%±1.00%)及Ad-EGFP组(69.57%±2.15%)明显降低(P<0.01);S期所占比例,Ad-siRNA/PTEN组(30.70%±5.13%)较Control组(13.13%±1.78%)及Ad-EGFP组(12.37%±1.33%)明显增高(P<0.01);G2/M期所占比例,Ad-siRNA/PTEN组(11.60%±2.72%)低于Control组(18.73%±2.78%)及Ad-EGFP组(18.40%±2.79%)(P<0.01);Control组与Ad-EGFP组之间差异无统计学意义(P>0.05)。④腺病毒感染HSC后72 h,Western blot分析各组HSC cyclinD1蛋白表达,Ad-siRNA/PTEN组(2.78±0.18)较Control组(1.93±0.12)及Ad-EGFP组(1.87±0.03)显著增高(P<0.01);而Control组与Ad-EGFP组之间无明显差异(P>0.05)。⑤腺病毒感染HSC后72 h,Western blot检测各组HSC CDK4蛋白表达,Ad-siRNA/PTEN组(0.49±0.01)较Control组(0.41±0.01)及Ad-EGFP组(0.39±0.02)增加(P<0.01);Control组与Ad-EGFP组之间差异无统计学意义(P>0.05)。⑥腺病毒感染HSC后72 h,Western blot分析各组HSC P27kip1蛋白表达,Ad-siRNA/PTEN组(1.57±0.03)低于Control组(1.91±0.03)及Ad-EGFP组(1.95±0.02),P<0.01;Control组与Ad-EGFP组之间无明显差异(P>0.05)。⑦腺病毒感染HSC后72 h,Western blot分析各组HSC Akt蛋白表达,Ad-siRNA/PTEN组(2.71±0.22)低于Control组(3.4±0.16)及Ad-EGFP组(3.39±0.38),P<0.01;Control组与Ad-EGFP组之间无明显差异(P>0.05)。⑧腺病毒感染HSC后72 h,Western blot分析各组HSC p-Akt(Thr308)蛋白表达,Ad-siRNA/PTEN组(2.27±0.02)高于Control组(1.69±0.01)及Ad-EGFP组(1.74±0.01),P<0.01;Control组与Ad-EGFP组之间p-Akt(Thr308)表达无显著差别(P>0.05)。⑨腺病毒感染HSC后72 h,Western blot分析各组HSC ERK蛋白表达,Ad-siRNA/PTEN组(0.37±0.03)低于Control组(0.48±0.04)及Ad-EGFP组(0.54±0.04),P<0.01;Control组与Ad-EGFP组之间无显著差别(P>0.05)。⑩腺病毒感染HSC后72 h,Western blot分析各组HSC p-ERK蛋白表达显示Ad-siRNA/PTEN组(4.47±0.08)高于Control组(3.29±0.08)及Ad-EGFP组(3.36±0.04),P<0.01;Control组与Ad-EGFP组之间p-ERK表达无显著差异(P>0.05)。结论:重组腺病毒Ad-siRNA/PTEN及空病毒Ad-EGFP成功转染体外活化HSC;Ad-siRNA/PTEN显著促进体外活化HSC细胞周期G1/S期转化;同时在翻译水平上上调活化HSC的cyclinD1、CDK4表达,下调P27kip1表达,并促进Akt与ERK的磷酸化,这可能是其促进活化HSC细胞周期进程的重要机制之一。