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香蕉穿孔线虫[Radopholus similis（Cobb, 1893）Thorne, 1949]是一种重要的迁移性内寄生植物病原线虫，主要分布于热带、亚热带地区以及一些温带地区的温室中，为害香蕉（Musa spp.）、柑橘（Citrus reticulata）、胡椒（Piper nigrum）和多种观赏植物和经济作物。对于该线虫致病的分子机制研究甚少。为了在分子水平上深入了解香蕉穿孔线虫的发育、繁殖和寄生特性，本研究用Illumina HiSeq? 2000平台，首次对香蕉穿孔线虫卵、幼虫、雌虫和雄虫4个发育阶段的转录组进行de novo测序和分析。并以获得的香蕉穿孔线虫转录组数据为基础对5个果胶裂解酶（PEL）基因和1个丝氨酸羧肽酶基因（Rs-scp-1）进行了RNAi研究，取得了以下主要结果：
1.通过对香蕉穿孔线虫不同发育阶段的高通量测序，在香蕉穿孔线虫卵、幼虫、雌虫和雄虫的转录组中分别获得了51,981、55,176、45,129、39,599个unigenes，混合拼接得到香蕉穿孔线虫的转录组，共计64,761个转录本，其中48,432个unigene注释在5个数据库中，预测蛋白编码框（CDS）共计54,066个，其中比对到蛋白库的CDS有47,895个。卵发育为幼虫期间有6,159个差异表达转录本，其中上调转录本2,613个、下调3,546个；幼虫发育为雌虫期间的差异表达转录本2,218个，其中1,350个转录本上调表达；在幼虫发育为雄虫过程中5,649个转录本差异表达，包括了3,214个上调表达转录本和2,435个下调表达转录本。预测到与线虫对寄主侵染致病、克服寄主防御反应以及其他生命活动相关的假定基因相似的转录子中，有 86 个疑似细胞壁降解酶基因的转录本、102个疑似抗氧化酶基因的转录本和109个与已知的植物寄生线虫致病基因序列相似的转录本。可能参与趋化性的转录本2,442个，还有273个转录本与秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）RNAi通路中的34个基因的序列相似。还发现744个转录本与寄主柑橘的基因序列高度相似的转录本，其中741个转录本仅在幼虫中表达，3个转录本在幼虫和雌虫中表达，这些转录本可能主要参与了有机物代谢、细胞代谢、物质合成和含氮化合物合成等过程。
2.根据香蕉穿孔线虫转录组中的疑似果胶裂解酶的转录本信息，克隆获得了5个香蕉穿孔线虫果胶裂解酶基因，Rs-pel-1、Rs-pel-2、Rs-pel-3、Rs-pel-4和Rspel-5。香蕉穿孔线虫Rs-pel-1、-2、-3、-4、-5基因开放阅读框长度分别为843 bp、819 bp、873 bp、771 bp和810 bp，编码氨基酸长度分别为280、272、290、256和269 aa。5个PEL蛋白均为膜外蛋白，其中RsPEL-2、-4和-5具有信号肽，Rs-PEL-1和Rs-PEL-3不具有信号肽。5个Rs-pel基因均定位在食道腺；Rs-pel-2、Rs-pel-3、Rs-pel-4和Rs-pel-5在幼虫中表达量均高于其他虫态，Rspel-1表达量最高的是雌虫，其次是雄虫。
3. 对Rs-pel-1、-2、-3、-4、-5和 Rs-scp-1进行了RNAi研究。Rs-pel-1、-2、-3、-4、-5经相应靶基因dsRNA浸泡后表达量均显著降低（p<0.05）并均在浸泡24 h后表达量降至最低，经RNAi处理后的线虫接种胡萝卜愈伤组织后，胡萝卜愈伤组织的受侵染症状减弱，线虫繁殖力下降。线虫经Rs-scp-1 dsRNA浸泡后靶基因的表达显著下降（p<0.05），沉默效果最佳浸泡处理时间为12 h；经RNAi处理后的香蕉穿孔线虫接种红掌（Anthurium andraeanum）后的繁殖量和致病力都明显降低。
本研究对不同发育阶段的香蕉穿孔线虫进行了转录组测序和分析，在迁移性植物寄生线虫中尚属首次。揭示了迁移性内寄生线虫与固着寄生线虫在致病基因种类、数量以及发育表达模式上的差异，并首次在植物寄生线虫中发现大量的水平转移自寄主植物的转录本。在转录组测序分析的基础上，克隆了5个定位于食道腺的果胶裂解酶基因，并明确了组织表达位置和发育表达模式，这是首次在迁移性植物寄生线虫中鉴定克隆多个不同类型果胶裂解酶基因，揭示了植物寄生线虫果胶裂解酶基因类型和表达模式的多样性。对果胶裂解酶和丝氨酸羧肽酶基因的RNAi研究，证实了这些基因与香蕉穿孔线虫发育和致病性的关系。本研究结果，将有利于更深入的了解香蕉穿孔线虫的分子致病机理和更有效的寻找防治香蕉穿孔线虫的新靶标。
1.通过对香蕉穿孔线虫不同发育阶段的高通量测序，在香蕉穿孔线虫卵、幼虫、雌虫和雄虫的转录组中分别获得了51,981、55,176、45,129、39,599个unigenes，混合拼接得到香蕉穿孔线虫的转录组，共计64,761个转录本，其中48,432个unigene注释在5个数据库中，预测蛋白编码框（CDS）共计54,066个，其中比对到蛋白库的CDS有47,895个。卵发育为幼虫期间有6,159个差异表达转录本，其中上调转录本2,613个、下调3,546个；幼虫发育为雌虫期间的差异表达转录本2,218个，其中1,350个转录本上调表达；在幼虫发育为雄虫过程中5,649个转录本差异表达，包括了3,214个上调表达转录本和2,435个下调表达转录本。预测到与线虫对寄主侵染致病、克服寄主防御反应以及其他生命活动相关的假定基因相似的转录子中，有 86 个疑似细胞壁降解酶基因的转录本、102个疑似抗氧化酶基因的转录本和109个与已知的植物寄生线虫致病基因序列相似的转录本。可能参与趋化性的转录本2,442个，还有273个转录本与秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）RNAi通路中的34个基因的序列相似。还发现744个转录本与寄主柑橘的基因序列高度相似的转录本，其中741个转录本仅在幼虫中表达，3个转录本在幼虫和雌虫中表达，这些转录本可能主要参与了有机物代谢、细胞代谢、物质合成和含氮化合物合成等过程。
2.根据香蕉穿孔线虫转录组中的疑似果胶裂解酶的转录本信息，克隆获得了5个香蕉穿孔线虫果胶裂解酶基因，Rs-pel-1、Rs-pel-2、Rs-pel-3、Rs-pel-4和Rspel-5。香蕉穿孔线虫Rs-pel-1、-2、-3、-4、-5基因开放阅读框长度分别为843 bp、819 bp、873 bp、771 bp和810 bp，编码氨基酸长度分别为280、272、290、256和269 aa。5个PEL蛋白均为膜外蛋白，其中RsPEL-2、-4和-5具有信号肽，Rs-PEL-1和Rs-PEL-3不具有信号肽。5个Rs-pel基因均定位在食道腺；Rs-pel-2、Rs-pel-3、Rs-pel-4和Rs-pel-5在幼虫中表达量均高于其他虫态，Rspel-1表达量最高的是雌虫，其次是雄虫。
3. 对Rs-pel-1、-2、-3、-4、-5和 Rs-scp-1进行了RNAi研究。Rs-pel-1、-2、-3、-4、-5经相应靶基因dsRNA浸泡后表达量均显著降低（p<0.05）并均在浸泡24 h后表达量降至最低，经RNAi处理后的线虫接种胡萝卜愈伤组织后，胡萝卜愈伤组织的受侵染症状减弱，线虫繁殖力下降。线虫经Rs-scp-1 dsRNA浸泡后靶基因的表达显著下降（p<0.05），沉默效果最佳浸泡处理时间为12 h；经RNAi处理后的香蕉穿孔线虫接种红掌（Anthurium andraeanum）后的繁殖量和致病力都明显降低。
本研究对不同发育阶段的香蕉穿孔线虫进行了转录组测序和分析，在迁移性植物寄生线虫中尚属首次。揭示了迁移性内寄生线虫与固着寄生线虫在致病基因种类、数量以及发育表达模式上的差异，并首次在植物寄生线虫中发现大量的水平转移自寄主植物的转录本。在转录组测序分析的基础上，克隆了5个定位于食道腺的果胶裂解酶基因，并明确了组织表达位置和发育表达模式，这是首次在迁移性植物寄生线虫中鉴定克隆多个不同类型果胶裂解酶基因，揭示了植物寄生线虫果胶裂解酶基因类型和表达模式的多样性。对果胶裂解酶和丝氨酸羧肽酶基因的RNAi研究，证实了这些基因与香蕉穿孔线虫发育和致病性的关系。本研究结果，将有利于更深入的了解香蕉穿孔线虫的分子致病机理和更有效的寻找防治香蕉穿孔线虫的新靶标。