论文部分内容阅读
漆酶是一类含铜的多酚氧化酶，它的合成分泌存在有一系列的转译后加工过程(如糖基化等)，一般认为漆酶蛋白的异源表达是比较困难。另外，漆酶的某些性质如氧化还原电位较低，高温易失活等也阻碍了它在实际中的应用。
野生革耳是新发现的一种能生产组成型漆酶的白腐真菌，该菌产生的漆酶具有较好的热稳定性，是一种极具研究价值和开发潜力的真菌漆酶。本研究中首先利用PCR扩增的方法在野生革耳漆酶基因lcc的3’端添加了编码5个氨基酸的酵母偏爱密码子，得到了改造的野生革耳漆酶基因lccT。将基因lcc和lccT分别连接到毕赤酵母表达载体pPICZαA中，转化毕赤酵母进行分泌表达，获得了重组野生型漆酶LCC及其突变体LCCT。通过研究不同温度和铜离子浓度对漆酶表达活性影响的结果，当诱导培养温度为20℃，培养基中CuSO4浓度为0.3mM时漆酶的表达活性最高。在此条件下比较诱导表达的重组漆酶LCC和LCCT的活性，发现LCCT的最大酶活(192U/L)是LCC的最大酶活(42.9U/L)的4.5倍。这一结果表明漆酶C-端序列对其活性有较大影响。诱导表达漆酶LCCT经过分子筛和离子交换层析得到电泳纯的漆酶蛋白LCCT，pH4.5时的比活力为3.68U/mg。根据SDS-PAGE测定的重组漆酶LCCT的表观分子量为61.6kDa。以ABTS为底物时的最适反应pH值为2.6，最适温度为45℃。氧化ABTS的Km值为0.61mmol/L，对应的Vmax为12.21μmol/min。重组漆酶LCCT在60℃的半衰期为8min。在50℃保温1h保留酶活71％，50℃以下保温1h保留酶活均大于80％。
为了获得高活性的漆酶，我们利用定点突变和易错PCR的方法对基因lccT进行改造。
通过定点突变，使重组漆酶LCCT中第459位上的Asp(D)突变为Glu(E)，得到的重组漆酶突变体LCCTM459纯化后的比活力在pH4.5时为8.54U/mg。根据SDS-PAGE测定的重组漆酶LCCT459表观分子量为61.5kDa，以ABTS为底物测得最适反应pH值为3.0，最适温度45℃。氧化ABTS的Km值为0.16mmol/L，Vmax为20.04μmol/min。重组漆酶LCCTM459在70℃保温10min酶活完全丧失，60℃的半衰期为8min。在50℃保温1h保留酶活14％，50℃以下保温1h保留酶活均大于50％，说明在50℃以下的温度重组漆酶LCCTM459的活性相对稳定，利用易错PCR(error-pronePCR)的方法对漆酶基因lccT进行随机突变，克隆到表达载体在酵母中表达。在平板上对活性进行筛选，分离到一株突变体以及有3个突变点(Asn193→Ser193，Asn205→Asp205，Ala304→Thr304)表达产物LCCTE。它的表达产物LCCTE的比活力在pH4.5时为16.17U/mg。根据SDS-PAGE测定的重组漆酶LCCTE的表观分子量分别为59.8kDa，以ABTS为底物测得最适反应pH值为3.6，最适温度55℃。氧化ABTS的Km值为0.15mmol/L，Vmax为74.07μmol/min。60℃的半衰期为15min。在50℃保温1h保留酶活43％，50℃以下保温1h保留酶活均大于70％，说明在50℃以下的温度重组漆酶LCCT的活性较稳定，比较得到的3个突变蛋白发现，LCCTE的比活力分别比LCCTM459和LCCT提高了2.3和4.4倍，最适温度提高了10℃，最适pH值比LCCT提高一个单位，氧化ABTS的Km值比LCCT和LCCTM459降低。但是在50℃时的热稳定性比LCCT下降。
本研究尝试在原核表达系统中表达野生革耳漆酶基因，并对表达产物进行复性研究。我们将目的基因lccT连接到大肠杆菌表达载体pET-22b(+)中，在大肠杆菌RosettaTM中实现了目的蛋白的表达。目的蛋白在全菌中约占48％。超声处理菌体，在胞质上清中发现有可溶漆酶蛋白。在可溶漆酶蛋白中添加CuSO4至不同的终浓度并在室温下孵育复性，获得有活性的漆酶。对在不同温度下获得的可溶漆酶蛋白复性研究发现，在20℃下培养获得的可溶漆酶经过相同的孵育时间后的活性较在37℃下培养获得的可溶性漆酶高；而在相同孵育时间内获得高活性复性产物所需铜离子浓度各不相同。在同一培养温度下获得的可溶性漆酶在室温下随着孵育时间的增加活性有下降的趋势。本工作是首次报道真菌来源的漆酶基因在大肠杆菌中实现表达。