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目的原发性醛固酮增多症(原醛症)是一组以醛固酮分泌增多,肾素-血管紧张素系统受抑制但不受钠负荷调节为特点的疾病。2011年Lifton等首次报告36.4%的散发性醛固酮分泌瘤患者有KCNJ5基因的体系突变。该研究立刻引起了全球广大内分泌医师的广泛关注,但我国国内目前尚未见相关报道。本研究采用PCR测序的方法检测KCNJ5基因在原醛症不同分型即醛固酮分泌瘤(APA)、特发性醛固酮增多症(IHA)、家族性醛固酮增多症(FH)及皮质醇分泌瘤(CPA)、嗜铬细胞瘤(PCC)中的突变情况,并分析基因型与临床表现型的关系,初步探讨KCNJ5基因在肾上腺皮质疾病中的作用。方法1、提取APA(n=48)、IHA的肾上腺结节样增生(NH,n=9)、CPA(n=5)、PCC(n=5)患者组织的总DNA及RNA；提取相应的APA(n=12)及IHA肾上腺结节样增生(n=3)患者外周血DNA作为对照；另提取IHA(n=10)、FH(n=4)患者的外周血DNA：2、DNA经PCR扩增KCNJ5基因后正反向测序,再将相应的RNA逆转录为cDNA后行PCR扩增KCNJ5基因正向测序,检测上述不同组织中KCNJ5基因的序列；3、分析KCNJ5基因不同突变型与临床表现型之间的关系。结果1、原醛症患者的KCNJ5基因突变1)54.2%的APA患者(25/48例)的肿瘤组织中存在p.G151R或p.L168R的杂合突变,而与其相匹配的12例患者外周血的基因测序正常；2)25例突变中48%(n=12)为p.G151R突变,52%(n=13)为p.L168R突变；p.G151R突变分别为c.451G>A(n=10)或c.451G>C(n=2)：而p.L168R均为c.503T>G;3)1例APA患者(1/48例)存在缺失突变,即157位的异亮氨酸(I1e)缺失,为p.157dell或c.469-471delATC;4)1例APA患者(1/48例)存在插入突变,即在148位氨基酸后插入苏氨酸(Thr),为p.148dupT或c.444-445insAAC;该突变目前国内、外尚未见报道;5)IHA结节样增生组织中2例(2/9例)为p.G151R(均为c.451G>C)杂合突变,3例(3/9例)为p.L168R杂合突变。2、原醛症中KCNJ5基因突变患者的临床表型1)KCNJ5基因突变型组与非突变型组APA患者的临床表型区别KCNJ5突变型组较非突变型组有较低的BMI(P<0.01)、较长的低血钾病史(P<0.01)和明显低的血钾水平(P<0.01)；在平衡了年龄及性别因素后,突变型组患者的卧、立位醛固酮水平及ARR仍高于非突变型组(P<0.05)、卡托普利试验的醛固酮抑制率明显低于非突变型组(P<O.05)；尽管服用高剂量螺内酯治疗,突变型组患者仍有较高的血压水平(P<0.01)。而对血管紧张素Ⅱ的反应、肿瘤直径、性别、高血压病史等在突变型组和非突变型组患者间无差异；肿瘤切除后两组患者的血钾均恢复正常,但突变型组患者术后的血压水平仍高于非突变型组(P<O.05)2)KCNJ5基因p.G151R或p.L168R突变型组APA患者的临床表型KCNJ5基因p.G151R或p.L168R突变型组APA患者之间的年龄、BMI、高血压和低血钾病史、血压、醛固酮水平、瘤体直径等均无差异；但p.G151R突变型组患者较非突变型组的BMI较低(P<0.05)、低钾血症病程较长(P<0.05)、血钾水平较低(P<0.01)、血压较高(P<O.05)、卧立位醛固酮水平及术后的舒张压较高(P<0.05)；而p.L168R突变型组较非突变型组患者年轻(P<0.05)、BMI较低(P<0.05)、低血钾病程更长(P<0.05)、血钾水平较低(P<0.01)、血压较高(P<0.01)、ARR水平较高(P<0.05)及卡托普利对醛固酮的抑制率较低(P<0.05)。3)KCNJ5基因突变型组的IHA肾上腺结节样增生患者的临床表现与非突变型组比较无统计学差异；但IHA结节样增生突变型组患者比APA突变型患者的卡托普利对醛固酮的抑制率高(P<0.05)。3、原醛症患者KCNJ5基因的单核苷酸多态性与SNP数据库资料比较,APA患者KCNJ5基因突变的SNP基因型未显示有统计学差异(P>0.1)。结论1、我们的结果显示：散发性APA患者的KCNJ5基因的体系突变发生率为56.3%(27/48例),此突变率高于欧洲(34%,129/380例)、澳大利亚(38%,10/27例)、英国(44%,20/46例)而接近日本(65.2%,15/23例)。提示KCNJ5基因突变率有种族差异。2、散发性IHA结节样增生患者中也存在KCNJ5基因的体系突变,但结节周边组织未显示KCNJ5基因突变。因例数较少,故尚需增加例数来做进一步研究。3、CPA及PCC患者中未见KCNJ5基因的突变。4、KCNJ5基因的p.G151R和p.L168R突变,导致APA患者的不同临床表现,提不KCNJ5基因突变在散发性APA患者疾病发生中有重要作用。5、本研究人群中检测到p.L168R、p.G151R、p.del157I和p.148dupT四种KCNJ5基因突变类型,其中p.148dupT突变型目前未见国内外文献报道。目的第一部分研究检测了原醛腺瘤中KCNJ5基因的突变情况及与临床表现的关系,本部分进一步从蛋白水平探讨KCNJ5蛋白的表达在肾上腺皮质疾病中的作用,并分析KCNJ5基因突变型组与非突变型组之间在表达水平上的异同。方法1、提取正常肾上腺皮质(n=8),原醛症(n=43)包括醛固酮分泌瘤(APA,n=38)和结节样增生(NH,n=5),肾上腺皮质醇分泌瘤(CPA,n=7),嗜铬细胞瘤(PCC,n=6)组织的总蛋白,并测定蛋白浓度。2、Western blot方法检测上述不同组织中KCNJ5蛋白和内参GAPDH蛋白的表达；分析目的条带和内参照条带的灰度比值,对KCNJ5蛋白的表达进行半定量分析。3、比较KCNJ5基因突变型组与非突变型组组织中KCNJ5蛋白表达的差异,并结合KCNJ5蛋白表达水平与相应患者的临床资料行相关性分析。结果1、KCNJ5蛋白的表达1) KCNJ5蛋白的表达在正常肾上腺皮质均高于原醛腺瘤、肾上腺皮质结节样增生和肾上腺皮质醇分泌瘤,差异有统计学意义(P<0.01)；2)醛固酮分泌瘤中非突变型组均高于突变型组、肾上腺皮质结节样增生组、肾上腺皮质醇分泌瘤和嗜铬细胞瘤(P<O.05)；3)醛固酮分泌瘤p.G151R突变型组和p.L168R突变型组之间KCNJ5蛋白表达量无统计学差异(P>0.05)；4)嗜铬细胞瘤组织表达KCNJ5蛋白,其表达量和皮质醇分泌瘤之间无差异(P>0.05)。2、KCNJ5蛋白表达量与KCNJ5基因突变KCNJ5蛋白表达量与KCNJ5基因突变与否呈正相关,r=0.516,P=0.005。3、KCNJ5蛋白表达量与APA患者临床表型间的关系KCNJ5蛋白表达量与KCNJ5突变的APA患者临床表现型无明显相关；与无KCNJ5突变的APA患者的临床表现型亦无明显相关。结论1、KCNJ5蛋白在原醛症患者组织中表达低于正常肾上腺,其中KCNJ5基因突变者组织中表达更低,提示KCNJ5基因突变与其蛋白表达下降有关。2、KCNJ5蛋白的表达与APA患者的临床表现型无相关。3、KCNJ5蛋白在皮质醇分泌瘤及嗜铬细胞瘤中的表达低于正常肾上腺皮质,其意义有待做进一步研究。