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毒蕈碱型乙酰胆碱受体(MACHR)，简称M受体，是G—蛋白藕联受体家族(GPCR)的成员之一，在与相应的配体结合后，与G—蛋白相藕联，介导激素、神经递质等细胞外界因素的信号转导，从而引起细胞的功能及活动，调节神经信号的传递、认知记忆、心血管活动、腺体分泌、平滑肌收缩等多种生理功能。分子生物学上根据克隆的五种不同编码的基因将M受体分为五个亚型，即m1—m5；药理学上将M受体根据其相应的特异性激动剂与拮抗剂分为M1—M4四种亚型。其中m1、m2、m3、m4分别对应于M1、M2、M3、M4，m5受体亚型未找到与之相对应的药理学分型。各种亚型的基本结构相似，主要差别在于胞浆内3环的不同，这决定了它们的功能的不同。
M3受体亚型广泛分布于中枢及周围组织中，在中枢神经系统中，如大脑中存在m1—m5各种亚型。在外周组织中，M3受体广泛分布于胃肠道平滑肌、膀胱逼尿肌、心肌及各种腺体中。M受体是G蛋白藕联受体家族的一员，具有该家族特征性的结构。七个跨膜区，三个膜内环和三个膜外环以及位于胞外的N端及位于胞内的C端。五个mACHR亚型蛋白分子量约51—66KD，由460-590个氨基酸残基组成，N端在膜外，C端在膜内，它七次穿过细胞膜，组成七个跨膜疏水区(Tm1—7)，三个膜外环(O1—3)和三个膜内环(i1—3)，五个亚型的跨膜区Tm1—7比较相似，膜外的三个环袢O1—3及i1—2在亚型间也比较保守，但N端，C端及i3环变异较大，i3环在胞浆内形成一个柱状的α螺旋结构，M受体就是在此与G蛋白结合而引起的一系列生理、生化反应。M受体介导的信号转导过程由受体、传导体(G—蛋白)、效应器三部分组成。G蛋白处于非活化状态时，G蛋白以异三聚体形式存在于细胞膜上，α亚基与GDP结合，与βγ异二聚体结合在一起。
当激动剂与M受体结合时，M受体蛋白分子空间构象发生改变，与G蛋白α亚单位相接触，α亚基与GTP结合，与βγ亚基解离，Gα—GTP和Gβγ能分别作用于效应蛋白，调节细胞内的效应蛋白的生物学活性，实现细胞内外的信号传递。当M受体与激动剂结合的信号解除时，完成了信号传递作用的α亚单位同时具备了GTP酶活性，分解GTP，生成GDP，与效应蛋白分离，再与βγ亚基结合，重新形成非活性的G蛋白三聚体。
根据组成的G蛋白的α亚单位的结构与活性，目前已知的G蛋白被分为Gs家族，Gq家族，Gi/o家族和G12/13家族。目前发现有21种α亚基，6种β亚基和12种γ亚基，形成多种特异性结合。
五种亚型的M受体因与G蛋白藕联的机制不同分为两组：调节PIP3水解类的M1组(M1、M3、M5)和抑制腺苷酸环化酶活性类的M2组(M2、M4)，M3受体与Gq/11蛋白藕联，受体的激活引起G蛋白三聚体解离，α亚单位与GTP结合，激活磷脂酶C(PLC)，第二信使三磷酸肌醇(IP3)和甘油二酯(DG)合成增多，引起细胞内钙库释放，细胞内钙浓度增加，进而引起蛋白激酶C(PKC)、腺苷酸环化酶(AC)、磷酸二酯酶(PDE)、钙调素(CAM)等活性的改变。
本研究以M3和G11α为研究对象观察M受体与G蛋白的藕联关系。采用PCR技术将编码M3受体与G11α蛋白的CDNAS进行连接并重组到PBacPAK9病毒载体内，通过病毒转染Sf9细胞，可以获得细胞膜上大量表达的M3受体与G11α蛋白的融合蛋白，本研究以这种高效藕联的M3—G11α融合蛋白为研究对象，检测在不同配体作用下，M3—G11α融合蛋白的表达和功能的变化，探讨信号转导中分子间相互作用的机制和影响因素。
材料与方法:
一、材料
M3扩增引物M3BamH1和M3—C末，G11α扩增引物M3—G11α和G11α—SalⅠ，pBacPAK9，T4连接酶，Taq聚合酶，BmaHⅠ限制性内切酶，SalⅠ限制性内切酶，dNTP等受赠于日本东京大学医学部神经生化教研室。PCR反应试剂盒购于宝生物公司。BCA法测定膜蛋白浓度试剂盒购于凯基公司。Sf9昆虫细胞株受赠予北京大学生命科学院陈建国教授；TNM—FH昆虫细胞培养基购于Sigma公司；胎牛血清购于TBD公司；放射性配体[3H]QNB、[35S]GTPγs购于Amersham Pharmacia Biotech公司，乙酰胆碱、卡巴胆碱、匹鲁卡品、MCN—A343、4—damp、阿托品、GDP、达菲那新等购于Sigma公司。
二、方法
应用PCR扩增编码M3和G11α的目的cDNA片段，电泳检测目的cDNA片段的结构，用“ultracleanTM15 DNA purification kit from gel and solution”方法纯化目的cDNA。应用第二次PCR技术实现编码M3的cDNA与编码G11α的cDNA进行连接，并扩增连接体，电泳检测连接的结果并纯化，将纯化后的cDNA片段应用限制性内切酶连接到病毒载体中。构建pBacPAK9—M3—G11α重组蛋白的表达载体，Baculovirus—sf9—cell表达系统表达M3—G11α融合蛋白。用BCA蛋白分析方法测定膜蛋白的总浓度；用[3H]QNB做放射性配体饱和结合实验，测定融合蛋白的表达水平；用[35S]GTPγS做放射性配体竞争性替代结合实验，检测在激动剂或拮抗剂作用下M3受体与G11α相互作用的分子机制及其影响因素，筛选亚型特异性的激动剂或拮抗剂。
结果:
通过PCR方法成功的扩增了编码M3受体亚型与G11α亚基的cDNA，再通过二次PCR实现了编码M3受体亚型与G11α亚基的cDNA的重组连接，并应用限制性内切酶实现了编码M3—G11α的cDNA与病毒载体Pbacpak9的连接，并在Sf9细胞中成功的表达了M3—G11α的融合蛋白。接种病毒载体的Sf9细胞肿胀变大，大小不均，细胞内颗粒增多，继续培养48小时后收获细胞，提取病毒载体及细胞沉淀。从细胞沉淀中经消化、研磨、离心方法提取膜蛋白，BCA方法测定膜蛋白含量为2.86mg/ml，[3H]QNB放射性配体饱和结合实验结果，M3—G11α融合蛋白具有与[3H]QNB特异性的、高水平的结合位点，随着[3H]QNB放射性配体浓度的升高，融合蛋白与[3H]QNB的结合量逐渐增加，具有M受体与配体结合的特性，当[3H]QNB浓度为约6nmol/L时，基本达到饱和，表达水平为7.76nmol/g，融合蛋白具有M受体与配体高度亲和力的特性，在10umol/LGTPγS存在的条件下，融合蛋白与[3H]QNB放射性配体结合的饱和结合曲线明显下移，此时在达到饱和时测得的融合蛋白表达水平为3.92nmol/g，提示GTPγS通过与G蛋白的α亚单位结合，降低了非选择性M受体阻断剂QNB与M3受体的亲和力，反映出融合蛋白两组分间的藕联能力，可用于检测M3与G11α相互作用和信号转导机制及影响因素的研究。[35S]GTPγS结合实验检测乙酰胆碱(Ach)、匹鲁卡品(Pilo)为M3受体的完全激动剂；卡巴胆碱(Cch)、MCN—A—343为M3受体的部分激动剂；阿托品(Atro)、4—Damp、达菲那新(Dafi)为M3受体的阻断剂。
讨论：
近年来随着分子生物学技术的广泛应用，为研究M受体亚型及其信号转导提供了新的途径。本研究以高效藕联的M3—G11α融合蛋白为研究对象，检测在不同的配体作用下，M3—G11α融合蛋白的表达和功能的变化，探讨信号转导中分子间相互作用的机制和影响因素，筛选M3受体亚型特异性配体。
放射性配体[35S]GTPγS竞争性替代结合实验是研究G蛋白藕联受体特异性配体的敏感方法。在GDP替代[35S]GTPγS结合实验中，在不同的配体、不同浓度GDP存在时，[35S]GTPγS竞争性结合作用的变化表明不同配体可以引起替代结合曲线偏移的方向和幅度不同，这种偏移代表了M3—G11α融合蛋白中的G11α亚基与GDP的亲和力的大小，当M3受体被激动剂激动时会引起与之藕联的G蛋白的构象变化，降低了G蛋白α亚基与GDP的亲和力，使GDP容易从G蛋白α亚基上解离下来；当M3受体被阻断剂阻断时会引起与之藕联的G蛋白的构象变化，增加了G蛋白α亚基与GDP的亲和力，使GDP难以从G蛋白的α亚基上解离下来。即激动剂作用受体时，G蛋白α亚基与GDP的亲和力最小，部分激动剂次之，阻断剂更次之，而受体反向激动剂与受体结合时α亚基与GDP的亲和力最大。因此，通过分析GDP与M3—G11α融合蛋白亲和力的大小可以筛选和鉴定M3受体未知的特异性完全激动剂、部分激动剂、拮抗剂和反向激动剂。
M3—G11α融合蛋白表达为研究M3受体后信号转导机制提供了便利条件，同时也为筛选M3受体亚型特异性配体提供了可能性，为M3受体亚型特异性药物开发和研制提供了有力的实验手段。
结论:
杆状病毒—sf9细胞系统表达的M3—G11α融合蛋白具有与配体结合的特性及组分间藕联的能力，配体通过改变M3—G11α融合蛋白组分中的G蛋白的α亚基与GDP的亲和力来活化或抑制融合蛋白活性，这一特性可用于筛选受体特异性配体，本实验中乙酰胆碱(Ach)、匹鲁卡品(Pilo)为M3受体的完全激动剂；卡巴胆碱(Cch)、MCN—A—343为M3受体的部分激动剂；阿托品(Atro)、4—Damp、达非那新(Dafi)为M3受体的阻断剂。