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苯嗪草酮,商品名为Goltix,化学名为4-氨基-3-甲基-6-苯基1,2,4三嗪-5酮,是1975年联邦德国的拜耳(bayer)公司研制推广开发的低毒、低残留除草剂新品种。苯嗪草酮主要通过植物根部吸收,再输送到叶子内,通过抑制光合作用的希尔反应而起到杀草的作用。作为我国应用新型的除草剂之一,应用非常广泛。苯嗪草酮在土壤中的光解作用得到证实,在水中光解后产生氨基的脱氨基作用也被证实。但是目前国内外对苯嗪草酮的在动物体内的毒物动力学方面和药理学方面研究鲜有报道。所以阐明其在动物机体内的代谢过程有着非常重要的意义。本实验研究目的是通过动物模型研究分析苯嗪草酮在体内的生物转运过程。重点探讨了苯嗪草酮在大鼠体内的毒物动力学规律、组织分布及排泄情况,为进一步进行毒作用及机制研究奠定基础。 第一部分：苯嗪草酮高效液相色谱分析方法建立 目的:建立苯嗪草酮原药的高效液相色谱检测方法,对检测条件进行优化,并对建立的检测方法进行评估。 方法:分别改变紫外检测波长,流动相配比,柱温及流速对苯嗪草酮同一浓度标准溶液进行检测,建立并优化苯嗪草酮高效液相色谱检测方法;配置苯嗪草酮原药系列标准溶液浓度,通过建立的检测方法进行检测,得出标准曲线,分析相关性;以空白血清为例,配置高、中、低三种浓度标准溶液,对建立方法的回收率,日间日内精密度,样品常温下及冻融稳定性进行评估。 结果:经优化后HPLC检测苯嗪草酮原药条件为:色谱柱:150mm×4.6mm(i.d)不锈钢柱,内填μBondaparkC18,粒径:5μm;流动相:乙腈:水=1:1;流速:0.5mL/min;柱温为25°C;检测波长:306mm;进样量:20μl。苯嗪草酮出峰时间为4.36min;标准曲线线性相关R2=0.9999,最低检出限为0.2μg/ml,不同浓度平均回收率均在95.3％～105.20%之间,日内精密度均小于4.63%,日间精密度小于5.52%,常温下放置12小时稳定性RSD%均小于1.29%,-20℃冷冻10天溶解后稳定性RSD%均小于0.89%。 结论:建立的苯嗪草酮原药HPLC检测方法适用于对苯嗪草酮样本的检测。 第二部分：苯嗪草酮血药浓度随时间变化及毒代动力学参数研究 目的:观察苯嗪草酮在大鼠血清中的浓度随时间的变化,并求出主要血药动力学参数。 方法:随机选取健康成年雌雄大鼠各4只,雄性组染毒剂量为2000mg/kg,雌性组染毒剂量1360mg/kg,采用灌胃方式染毒,灌胃容量为0.5ml/100g,并于染毒后5、15、30min和1、2、4、8、12、24h采血,分离血清,经乙腈提取处理后,采用高效液相色谱法检测血清中苯嗪草酮的浓度,DAS3.0软件计算毒代动力学参数。 结果:雌雄大鼠于染毒5min后均检测到苯嗪草酮,血毒浓度均符合一级吸收一室模型,雄性毒动学方程为C=8.79(e-0.39t-e-1.04t),雌性大鼠毒动学方程为C=4.96(e-0.13t-e-2.01t)。雄性大鼠在染毒后血毒浓度达峰时间是Tmax=2h,达峰浓度为Cmax=65.96mg/L,雌性大鼠达峰时间是Tmax=3.5h,达峰浓度时为Cmax=40mg/L,雌雄大鼠毒物吸收半衰期t1/2Ka分别为0.76±0.13和0.69±0.13(h),吸收速率常数Ka分别为2.01±0.34和1.04±0.24(1/h),消除半衰期t1/2Ke分别为7.34±3.02和2.12±0.96(h),消除速率常数分别为0.13±0.02和0.39±0.20(1/h),药-时曲线下面积AUC0-t分别为1594.08±446.16和975.36±513.54(mg/L*h),AUC0-∞分别为1832.76±462.52和977.37±512.98(mg/L*h),清除率CL分别为0.78±0.21和2.58±1.40(L/h/kg),表观分布容积Vd分别为10.76±6.41和8.33±7.45(L/kg)。结论:苯嗪草酮经口染毒后能迅速的被大鼠吸收并达到高峰,提示在大鼠体内分布广泛,但是雌雄大鼠对毒物代谢具有明显的性别差异。 第三部分：苯嗪草酮在大鼠体内组织分布研究 目的:观察苯嗪草酮经消化道吸收后,在大鼠体内各个组织中的毒物分布及随时间变化的趋势。 方法:随机抽取健康SD雄性大鼠24只,分为6组,染毒后,分别在0.5h,2h,4h,8h,24h,168h,断头处死各组大鼠,取心,肝,脾,肺,肾,脑,睾丸,脂肪,肌肉组织,经匀浆,提取,离心,取上清,挥干,复溶制备样品后,通过高效液相色谱(HPLC)检测;通过EXCEL工具处理数据。 结果:雄性大鼠灌胃染毒后,0.5h可以在每个组织中检测到,每个组织中药物浓度随时间变化各具有特点,达峰时间不同,峰值也不同,其中肝脏的峰值含量最高,其次为心、脑、脾、脂肪、肌肉、肺、肾、睾丸;组织中药物浓度在4h前,均小于血液中浓度;在24h时苯嗪草酮在大鼠体内脂肪中含量仍较高;7d时,在心,脾,肺中仍可检测到原药。 结论:证实了苯嗪草酮在大鼠体内分布广泛,部分组织可能具有一定的蓄积性,同时说明苯嗪草酮可以通过血脑屏障和血睾屏障,是否具有神经毒性和遗传毒性还有待于经一步研究。 第四部分:大鼠对苯嗪草酮排泄方式研究 目的:观察苯嗪草酮排泄情况,检测粪尿中药物含量随时间的变化趋势及主要排泄方式。 方法:随机抽取健康SD雄性大鼠4只,经口一次性灌胃染毒后,放入代谢笼,连续7d同一时间收集粪尿,粪样经烘干,碾磨,提取,离心,取上清,挥干,复溶后制备;尿液经离心,过滤后,提取,分离,挥干,复溶后制备;粪尿样品通过HPLC检测,结果使用EXCEL工具处理。 结果:连续7天收集测定粪尿中苯嗪草酮含量,发现在第一天的粪尿中含量最高,之后呈下降趋势,粪便含量到第6天开始有在检测限以下,而尿液在第5天开始有在检测限以下;粪便中平均累积剂量占总剂量的百分比为71.44%,尿液中平均累积剂量占总剂量的百分比为8.91%。 结论:苯嗪草酮原药主要通过粪便排出体外。