【摘 要】
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乳房炎是奶牛的常见病和多发病，可由多种致病菌感染引起，其一直是对奶牛业危害最大、影响最广泛的疾病之一，因此，快速、准确的检测主要致病菌是采取有效措施预防奶牛乳房炎发生和
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乳房炎是奶牛的常见病和多发病，可由多种致病菌感染引起，其一直是对奶牛业危害最大、影响最广泛的疾病之一，因此，快速、准确的检测主要致病菌是采取有效措施预防奶牛乳房炎发生和控制其迅速传播的前提和关键，也是为临床合理选用药物提供依据的必要条件。本文的研究目的是建立针对6种常见奶牛乳房炎致病菌快速、准确、灵敏、高通量的基因芯片检测技术平台，为临床诊断、食品卫生监督、感染性疾病的防控等提供快速、有效的诊断手段。
以16SrDNA基因作为检测靶片段，选取6种常见奶牛乳房炎致病菌作为基因芯片检测的靶细菌，设计和筛选通用性弓l物和特异性探针，对通用引物进行荧光标记，优化PCR反应体系中各成份的用量及比例，并探讨核酸提取方法、杂交温度、杂交液成份等因素对基因芯片杂交的影响。根据杂交信号强度和聚类分析结果进而判定奶牛乳房炎感染的致病菌种类。在此基础上，确定基因芯片体系的cutoff值，评价基因芯片检测方法的灵敏度、特异性和重复性等性能指标。
6种奶牛乳房炎致病菌基因芯片检测方法的建立；本实验选取的靶致病菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、停乳链球菌、无乳链球菌。确定了最合适的基因组DNA提取方法为直接煮沸法，优化出最佳的PCR扩增条件为：两对引物的荧光引物与非荧光引物的比例为1：10，Mg2+浓度为2.0mmol/L，退火温度为57℃，退火时间30s。最佳杂交条件为:杂交温度为42℃，杂交液成分为5×SSC、0.2％SDS、2.5％甲酰胺。并确定了每种致病菌对应探针的cutoff值。对单一致病菌检测的灵敏度为103CFU/mL;批问批内变异系数CV值均小于15％。对78例临床样本进行检测，与常规培养法相比，正确率达到89.8％。
本研究建立的以16SrDNA为靶基因检测奶牛乳房炎6种主要致病菌的基因芯片方法，具有快速、准确、高通量等特点，可快速、灵敏、特异、准确的对6种试验菌株进行检测和鉴定，可为流行病学调查、食品卫生监督、乳房炎的防控等提供快速、有效的检测方法，具有重大的实践意义和市场前景。
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