斑点叉尾鮰源温和气单胞菌生物学及药物敏感性研究

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温和气单胞菌(Aeromonas sobria)属于嗜温有动力气单胞菌,是一种典型的人畜共患条件致病菌。是危害淡水养殖业的主要病原菌之一。2012年新乡市郊某斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)养殖场暴发了以体表和鳍条出血为主要症状的疾病,造成了所养斑点叉尾鮰的大量死亡。本研究观察记录了患病斑点叉尾鮰的临床症状,从濒死的病鱼体内分离获得优势菌,并对优势菌进行了病原生物学和体外药物敏感性研究。从患病斑点叉尾鮰的腹水、肝脏、肾脏、脾脏和肠道取样,在胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基上划线分离,纯化后得到一批优势菌。对纯化的菌株进行革兰氏染色、氧化酶实验、葡萄糖氧化发酵实验、菌体及菌落形态观察、弧菌科细菌生化鉴定系统(第二代GYZ—9V系统)鉴定,判定纯化的菌株属于气单胞菌属细菌,选取其中XX-1菌株,进行后续研究。根据已报道的气单胞菌属gyrB基因序列设计引物,对XX-1菌株的基因组DNA进行PCR扩增,目标条带经回收纯化后测序。测序结果在NCBI中进行同源性搜索,进化发多重序列比对和系统发育学分析。分子鉴定结果显示XX-1菌株为温和气单胞菌。根据气单胞菌属毒力基因的相关报道设计引物,采用多重PCR的方法,对XX-1菌株进行溶血素(Hem)、外膜蛋白(Omp)、气溶素(Aer)、丝氨酸蛋白酶(Ahp)、粘附素(Aha)和细胞兴奋性肠毒素(Alt)六种气单胞菌主要毒力基因检测,结果表明:XX-1菌株含有Ahp、Alt、Omp三种毒力基因。研究XX-1菌株在不同的温度、pH和盐度条件下,胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)液体培养基中的生长情况。结果表明:XX-1菌株可以在20~42℃的温度范围内生长,最适生长温度为32℃。在pH为5~9.5的范围内XX-1菌株生长良好,生长的最适pH为7.5。pH小于4和大于11时,XX-1菌株不生长。在低盐环境下XX-1生长良好,最适生长培养基中氯化钠含量为1.5%~2.5%。氯化钠含量达到4.5%时,XX-1菌株仍能缓慢生长,大于6.5%时,XX-1菌株不能生长。采用药敏纸片法检测XX-1菌株对29种常用抗生素的体外敏感性,结果显示:XX-1菌株对头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松、新霉素、红霉素、呋喃妥因、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星和恩诺沙星高度敏感,对青霉素G、羧苄青霉素、氨苄西林、阿莫西林、新生霉素、复方新诺明耐药。采用二倍稀释法测得乳酸恩诺沙星对XX-1菌株的体外最小抑菌浓度(MIC)为0.4mg/L,最小杀菌浓度(MBC)为3.2mg/L。乳酸恩诺沙星对XX-1菌株的体外杀菌作用与药物浓度呈正相关性,在1~8×MIC药物浓度范围内,随着药物浓度的增加杀菌作用增强。乳酸恩诺沙星对XX-1菌株表现出明显的抗生素后效应(PAE),在1~8×MIC药物浓度范围之内,PAE值随药物浓度的增加而增加。
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