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目的(1)建立检测恶性疟原虫Pfcrt基因K76T及Pfmdr1基因N86Y和D1246Y的点突变的方法；(2)了解我国恶性疟原虫分离株Pfcrt基因K76T及Pfmdr1基因N86Y和D1246Y的点突变特征及发生率；(3)了解我国恶性疟原虫分离株Pfcrt基因K76T及Pfmdr1基因N86Y和D1246Y的点突变发生率与恶性疟原虫对氯喹敏感性的关系，为这些分子标志用于氯喹抗性监测提供依据；(4)应用消减杂交技术，以伯氏疟原虫咯萘啶抗性RP株与敏感的ANKA株分别互为检测方和驱动方，构建消减cDNA文库，为进一步深入开展咯萘啶抗药机制及其应对策略与技术的研究提供可靠的依据和可行的途径。
方法(1)本研究自我国恶性疟流行区云南和海南省采集恶性疟现症患者血样，根据恶性疟原虫Pfcrt基因和Pfmdr1基因序列设计巢式PCR引物，以血样中的恶性疟原虫DNA为模板，进行巢式PCR-RFLP分析，并对部分PCR产物进行纯化、测序及同源性分析。(2)采用世界卫生组织(WHO)制定的体外微量法测定同一批血样中恶性疟原虫对氯喹的敏感性。(3)为获得咯萘啶抗性株(RP株)或敏感株(ANKA株)高表达或特异表达的基因，以RP株和ANKA株互为检测方和驱动方，进行正向或反向抑制性消减杂交，并经两轮PCR，获得正、反向消减杂交产物。杂交产物纯化后，经克隆、转化和PCR扩增，观察插入片段大小，获得消减cDNA文库。
结果(1)云南、海南省恶性疟原虫Pfcrt基因K76T的突变发生率分别为86.7％和64.3％，野生型K76等位基因发生率为8.9％和21.4％，突变、野生型混合等位基因发生率分别为4.4％，14.3％；(2)云南、海南省恶性疟原虫Pfcrt基因第72-76位编码的氨基酸单元型在氯喹敏感株均为CVMNK，氯喹抗性株则可为CVIET(非洲、东南亚)、CVIKT(巴布亚新几内亚)和SVMNT(南美洲)。其中海南的氯喹抗性株Pfcrt基因第72-76位编码的氨基酸为单一的CVIET单元型，云南氯喹抗性株中除一株为CVIKT，另一株为SVMNT外，均为CVIET单元型。(3)云南、海南省恶性疟原虫Pfmdr1N86Y突变发生率分别为46.5％和3.4％，野生型N86等位基因发生率分别为41.9％，89.7％，野生型和突变型混合等位基因发生率分别为11.6％和6.9％。首次报道在海南的一恶性疟原虫分离株中存在Pfmdr186Y基因型，该虫株与东南亚的氯喹抗性分离株FCR3有100％的一致性。(4)本研究未发现云南、海南省恶性疟原虫分离株存在Pfmdr1D1246Y突变。(5)体外微量法测定云南血样54份，其中对氯喹有抗性的40份(74.1％)，敏感的14份(25.9％)。完全抑制裂殖体形成的平均药物浓度为3.98±1.06pmol/μl血，其中＜1.6pmol/μl血的例数占25.9％，1.6pmol/μl血-6.4pmol/μl血的例数占41.1％，＞6.4pmol/μl血的例数占32.9％。体外微量法检测海南血样36份，其中对氯喹有抗性的26份(72.2％)，敏感的10份(27.8％)。完全抑制裂殖体形成的平均药物浓度为3.02±1.86pmol/μl血，其中＜1.6pmol/μl血的例数占27.8％，1.6pmol/μl血-6.4pmol/μl血的例数占68.9％，＞6.4pmol/μl血的例数占3.1％。(6)Pfcrt76T等位基因分别存在于云南、海南省94.3％和80.9％的抗性株中，而敏感株中分别为60.0％和14.3％。Pfcrt76T突变发生率在体外微量测定法显示的氯喹抗性株与敏感株间的差异在统计学上有意义(云南：x2=14.55，P＜0.001；海南：x2=14.51，P＜0.001)。(7)等级相关分析结果显示，PfcrtK76T等位基因点突变率与恶性疟原虫抗性程度间呈高度正相关(等级相关系数rs=0.93，P＜0.001)。(8)Pfmdr1N86Y突变发生率在体外微量测定法显示的氯喹抗性株与敏感株分别为云南45.5％(15/33)和50％(5/10)，海南4.4％(1/23)和0，二者之间的差异在统计学上无意义(云南：x2=0.18，P=0.91；海南：x2=1.34，P=0.52)；但在云南和海南，该突变发生率分别为45.5％和4.4％，其差异在统计学上有意义(x2=15.5，P=0.025)。(9)本研究共向GenBank递交序列43个，其中PfcrtK76T的序列26个(登录号为DQ126073-126095和DQ114402-114404)、Pfmdr1N86Y的序列7个(登录号DQ114399-114401和DQ126096-126099)、Pfmdr1D1246Y的序列10个(登录号DQ114405-114414)。(10)经正、反向抑制性消减杂交后，分别获得有416个和309个重组子的正、反向差减文库。插入片段大小约在300-1000bp之间，提示伯氏疟原虫对咯萘啶的抗性可能涉及的是多个基因而不是个别基因；抗性表型不仅受抗性基因控制，也可能受敏感基因的影响。
结论(1)巢式PCR-RFLP法可以快速检测恶性疟原虫Pfcrt和Pfmdr1中的点突变，具有用于我国药物抗性研究与监测的前景。(2)我国云南、海南省恶性疟原虫氯喹抗性株具有Pfcrt76T突变的特点，其发生率与抗性程度呈正相关，显示pfcrtK76T作为分子标志在我国恶性疟原虫氯喹抗性监测中具有进一步应用的价值。(3)首次报道了我国云南、海南省抗氯喹恶性疟原虫Pfcrt基因第72-76位编码的氨基酸单元型有CVIET(非洲、东南亚)、CVIKT(巴布亚新几内亚)和SVMNT(南美洲)三种单元型及其在地域间的差异。(4)我国抗氯喹恶性疟原虫的Pfmdr1N86Y突变发生率与敏感株间未显示出差异；但具有地域差别，其意义及应用价值尚待进一步研究。(5)发现海南一抗氯喹恶性疟原虫现场分离株中存在Pfmdr186Y基因型，该虫株与东南亚的氯喹抗性分离株FCR3有100％的一致性。(6)本研究未发现云南、海南省恶性疟原虫株存在Pfmdr1D1246Y点突变。(7)本研究共向GenBank递交序列43个。(8)首次构建了咯萘啶抗性RP株与敏感的ANKA株的消减cDNA文库，为进一步分离、鉴定、克隆抗性相关基因，开展我国创制抗疟药物咯萘啶防治、策略与技术研究的奠定了重要基础。