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研究背景：产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和质粒介导头孢菌素酶(AmpC酶)是革兰阴性杆菌对β-内酰胺类抗生素耐药的主要机制。欧洲首先在肠杆菌科细菌中发现了超广谱β-内酞胺酶(Extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)，随后有关ESBLs的报道遍及世界各地。ESBLs是由革兰阴性菌，如肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、奇异变形杆菌、粘质沙雷氏菌、阴沟肠杆菌、不动杆菌和铜绿假单胞菌等产生的一种β-内酰胺酶，能够水解氧亚氨基(anoxyimino group)β-内酰胺抗生素，如第三代头孢菌素和单环酞胺类抗生素氨曲南。由于其水解底物较广谱β-内酰胺酶(TEM-1，TEM-2和SHV-1)更加广泛，故称之为ESBLs.AmpC酶是β-内酰胺酶中另一重要分支，最初认为是革兰阴性杆菌所产生的染色体介导头孢菌素酶；但近来研究表明，革兰阴性杆菌还产生质粒介导的AmpC酶，且传播速度更快、耐药性更强。AmpC酶最初是由Hennesseyu于1967年在一种阴沟肠杆菌中发现的可诱导的β-内酰胺酶，即目前所知染色体介导的AmpC酶。1988年，Papanicolaou等首次从患者样本分离的11株肺炎克雷伯菌中获得了质粒型AmpC酶，命名为MIR-1，随后质粒介导AmpC酶不断被发现。目前，有人将同时产ESBLs及质粒介导AmpC酶称为超超广谱β-内酞胺酶(Super-spectrum β-Lactamase，SSBL)。产ESBLs及质粒介导AmpC酶的肠杆菌科细菌的耐药问题是当前全球最重要的医院内感染耐药问题之一，且检测又是实验室的难点，另外，由于各地区流行的基因型不同而存在耐药性和检测底物的地区差别，因此，了解本地区产ESBLs及质粒介导AmpC酶的革兰阴性菌的最佳检测底物及耐药性特点，有利于防止产ESBLs株的区域性流行，并指导临床治疗，以免延误病情和造成浪费。鉴于近年广州地区尚无大范围的调查研究资料，2005年1月至2007年12月间，我们对广州市四家三甲医院临床标本中分离出的408株革兰阴性菌的ESBLs及质粒介导AmpC酶产生情况、耐药性进行了研究，并对经ESBLs表型确认试验及三维试验证实产ESBLs及质粒介导AmpC酶的革兰阴性菌进行了耐药基因的初步分型。
目的
寻求产ESBLs及质粒介导AmpC酶革兰阴性菌的最佳检测底物，并调查2005年1月至2007年12月广州地区产ESBLs及质粒介导AmpC酶革兰阴性菌的耐药流行状况，同时对耐药基因进行进一步研究，明确广州地区革兰阴性菌中编码β-内酰胺酶的基因亚型及其分布。
方法
收集广州地区四家大医院临床标本分离的革兰阴性菌共408株，采用VITEK32全自动微生物分析仪，对菌株进行重新鉴定，经初步筛选试验和表型确认试验筛选出产ESBLs及AmpC酶细菌。用标准纸片扩散法(Kirby-Bauer test)检测耐药性。
根据GenBank的基本序列设计TEM，SIN，CTX-M和OXA等15对引物，分别用这些引物对表型确认试验证实产ESBLs及AmpC酶的细菌进行PCR扩增并对PCR产物进行DNA测序。
结果
广州地区检测ESBLs的最佳底物是头孢噻肟，其次为头孢曲松；头孢他啶不宜作为该地区ESBLs的检测底物；质粒介导AmpC酶的最佳底物是头孢西丁。广州地区革兰阴性菌中ESBLs检出率为35.8％，AmpC为2.45％，同时产ESBLs及AmpC酶为0.98％。产酶株对头孢噻肟等16种抗生素的耐药率比不产酶株都有不同程度增加，但亚胺培南对所有产酶株都敏感。
146株产ESBLs细菌中，120株产CTX-M型β-内酰胺酶，52株产TEM型β-内酰胺酶，12株产OXA型β-内酰胺酶，除16株为CTX-M单独存在外，其余均与TEM、OXA共存；10株产AmpC菌株中，MOX阳性2株，CMY阳性1株，DHA阳性3株，ACC阳性1株，ACT阳性3株；共检出4株同时产ESBLs及质粒介导AmpC酶的革兰阴性菌，分别是同时产MOX和TEM；CMY、CTX-M-1、TEM和OXA-3；ACC、ACT、CTX-M-8和OXA-2大肠埃希菌三株。同时产DHA、CTX-M-2和CTX-M-141株肺炎克雷伯菌一株。
结论
本研究揭示了广州地区检测ESBLs的最佳底物是头孢噻肟，其次为头孢曲松和氨曲南；质粒介导AmpC酶的最佳底物是头孢西丁。如本地区单用头孢他啶作为筛选底物时，漏检率将会较高，故本地区用于ESBLs筛选的底物以头孢噻肟联合头孢曲松或氨曲南为宜。AmpC以头孢西丁及任一种三代头孢联合较佳。
本研究发现，广州地区革兰阴性菌中ESBLs的产生率高，流行广，应引起足够重视，严加控制。AmpC酶由于阳性标本较少，尚待进一步研究。临床资料及药敏资料证明产ESBLs及质粒介导AmpC酶革兰阴性菌是重要的医院内感染细菌，且呈多重耐药，治疗中碳青霉烯类药物是最可靠的；含β-内酰胺酶抑制剂的复合制剂耐药程度也较高，应适当增加剂量，并可与阿米卡星联合应用。
广州地区表型为产ESBLs的菌株中，主要基因型为CYX-M型β-内酞胺酶，其次为TEM型；质粒介导AmpC酶以DHA及ACT为多。出现了同时产ESBLs及质粒介导AmpC酶的革兰阴性菌，使相应细菌感染的控制更为棘手。