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树突状细胞(dendritic cells，DC)是体内功能最强的专职抗原提呈细胞，是免疫应答的启动者和调节者。成熟DC能有效提呈抗原、激活初始T细胞、启动适应性免疫应答；未成熟DC由于缺乏共刺激分子，诱导相应T细胞克隆无能或凋亡，从而产生免疫耐受。
Toll样受体(Toll-like-receptors，TLRs)是一组重要的模式识别受体(patternrecognition receptor，PRR)，主要存在于DC和巨噬细胞等固有免疫细胞表面。在TLRs家族中，TLR4主要识别脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，未成熟DC通过表面TLR4接受LPS刺激后可迅速发育成熟，共刺激分子CD80、CD86和MHC Ⅱ类分子的表达水平上调，IL-2、IL-12等细胞因子分泌增加。在TLR4介导的信号传导通路中，末端分子主要为转录因子AP-1和NF-κB。下游信号分子I-κB是NF-κB的主要调控蛋白，与多种生命活动有关，如细胞分化、成熟、炎性反应等。
地塞米松(dexamathone，DEX)是临床上广泛应用的免疫抑制剂，能够影响DC的成熟和抗原提呈功能，但具体的分子机制并不十分清楚。据文献报道和前期工作，推测DEX影响DC成熟的分子机制可能和TLR4信号传导途径有关。
因此，本课题从mRNA水平和蛋白水平观察DEX对小鼠DCTLR4表达的影响，同时分析药物对下游分子I-κB的影响，初步探讨DEX对DC作用的分子机制。主要研究结果总结如下：
1.建立检测TLR4mRNA的SYBR-Green I Real-timePCR实验。采用细胞因子定向诱导的方法体外培养C57BL/6小鼠骨髓源DC。应用RT-PCR技术分别从小鼠DC和脾细胞中获得TLR4和β-actin cDNA片段，与pUCm-T载体连接，构建重组质粒pUCm-T/TLR4和pUCm-T/β-actin，作为Real-time PCR实验的标准品。将重组质粒系列稀释，进行Real-time PCR反应，绘制扩增动力曲线、回归曲线和熔解曲线；分别于不同的时间点进行4次Real-time PCR反应，计算高拷贝数下(1010copy/mL)和低拷贝数下(104copy/mL)的变异系数，分析实验的稳定性。结果：扩增动力曲线和回归曲线显示，荧光信号的强度和质粒的初始拷贝数有良好的线形关系，相关系数(r2)>0.99，线形范围为104～10加(copy/mL)；熔解曲线为单一峰，即Real-time PCR产物具有较高的纯度；不同时间点的变异系数在13％以内。以上结果表明，实验具有良好的灵敏度、特异性和较好的稳定性。
2.DEX对DC TLR4 mRNA表达的影响。常规培养DC，于2、4、6、8、10、12 d收集细胞，各组细胞分别经CDllc抗体包被的免疫磁珠纯化，然后用SYBR-Green I Real-time PCR检测TLR4mRNA的表达。结果：纯化后，流式细胞术(Flow eytometry，FCM)检测CDllc阳性细胞纯度可达95％；DC正常情况下，未成熟状态(2～10 d)时其TLR4mRNA表达水平变化不大，成熟时(12 d)表达水平出现飞跃(p<0.01)，提示TLR4 mRNA表达水平与DC的发育阶段和功能密切相关。然后，比较了常规培养DC(对照组)与加入DEX(10-7M)培养的DC(DEX组)TLR4 mRNA表达情况。结果：4 d之后DEX组TLR4 mRNA表达高于对照组，提示DEX促进DC TLR4 mRNA表达。
3.DEX对DC TLR4蛋白质表达的影响。培养DC时分为5组：1组为常规培养8 d的DC，即对照组；其余4组加入DEX(10-7 M)分别刺激2，4，6，8 d，用荧光抗体双标记法通过流式细胞仪检测细胞表面CDllc和TLR4的表达，计算TLR4阳性细胞比率在CDllc阳性细胞中的百分比。结果：对照组和其余4组，其百分比分别为12.74％，36.76％，33.46％，53.68％，57.85％，表明DEX能上调DC表面TLR4的表达。
4.DEX对DC TLR4信号途径下游分子I-κB表达的影响。将常规培养6 d的DC分为4组：第1组不做任何处理，为对照组；第2组加入DEX(10-7M)刺激1 h；第3组加入LPS(100 ng/mL)刺激20 min第4组为联合组。用Western-Blot分析上述各组DC胞浆内I-κB表达。结果：对照组I-κB条带较淡，DEX组条带亮度明显加强，而LPS组条带非常淡，几乎不能显示。实验结果表明DEX能显著促进DC胞浆内I-κB的表达。实验结果表明，DEX可能通过TLR4-I-κB-NF-κB信号通路调节DC成熟和抗原提呈功能。