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目的:研究COX-2激活JNK/SAPK信号转导通路调控MDR1/P-gp介导的多药耐药的机制,并探讨健脾解毒方通过COX-2-JNK信号转导调节人结肠癌多药耐药的作用。
方法：采用MTT法检测人结肠癌HCT8和HCT8/V细胞对多种抗肿瘤药物(VCR、DDP、5-FU、THP)的敏感性,实时荧光定量PCR(RFQ-PCR)检测MDR1 mRNA的表达,Westernblot方法检测P-gp的表达,探讨HCT8/V细胞多药耐药性的机制。采用JNK信号通路特异性抑制剂sp600125(20μM,2h)抑制JNK信号通路的激活后,检测多药耐药HCT8/V细胞MDR1启动子转录活性的表达,MDR1 mRNA、P-gp表达的变化以及细胞内化疗药物浓度的变化和对化疗药物的耐药性的影响;采用COX-2特异性抑制剂NS-398(20μM,2h)抑制COX-2的表达后,检测多药耐药HCT8/V细胞MDR1启动子转录活性的表达,MDR1 mRNA、P-gp表达的变化以及细胞内化疗药物浓度的变化。
利用COX-2启动子荧光素酶报告基因及质粒转染、RFQ-PCR、Western blot、HPLC等方法研究:健脾解毒方对HCT8/V细胞MDR1/P-gp表达的影响以及细胞内的化疗药物浓度的变化,健脾解毒方对人结肠癌多药耐药HCT8/V细胞COX-2表达的影响及JNK信号通路c-Jun磷酸化的调控作用。
结果：人结肠癌耐药细胞HCT8/V的MDR1 mRNA表达与敏感细胞HCT8相比较,是其5.33倍,P-gp表达是其3.53倍(P＜0.01)。抑制JNK信号通路和COX-2表达均能够逆转HCT8/V细胞对VCR的耐药性,降低耐药细胞内长春新碱的浓度(P＜0.01),并且抑制人结肠癌多药耐药HCT8/V细胞MDR1启动子活性和MDR1/P-gp的表达(P＜0.01)。COX-2通过磷酸化JNK/SAPK信号通路c-Jun的Ser-63、Ser-73,激活JNK/SAPK信号转导通路介导的HCT8/V细胞多药耐药性,抑制COX-2可以阻止HCT8/V细胞JNK/SAPK信号通路的激活。同时发现,健脾解毒方能够逆转人结肠癌HCT8/V细胞的多药耐药性,并能抑制MDR1 mRNA、P-gp表达,增加HCT8/V细胞内化疗药物浓度,并呈剂量依赖性。Western blot结果显示,经5％健脾解毒方作用48hr后,HCT8/V细胞COX-2蛋白的表达明显降低,与空白血清组相比,P＜0.01;JNK/SAPK信号通路c-Jun的Ser-63、Ser-73位点的磷酸化表达降低,而空白血清组无明显变化(P＜0.01)。
结论：COX-2通过磷酸化JNK/SAPK信号通路c-Jun的Ser-63、Ser-73,激活JNK/SAPK信号转导通路介导HCT8/V细胞的多药耐药性。抑制COX-2可以抑制HCT8/V细胞JNK/SAPK信号通路的激活。通过抑制COX-2表达从而抑制JNK/SAPK信号通路介导的MDR1 mRNA、P-gp水平,进一步提高HCT8/V细胞内化疗药浓度,是健脾解毒方逆转人结肠癌HCT8/V细胞多药耐药的机制之一。