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NKG2D为生理状态下表达于NK、CD8+T、γδT、NKT细胞表面的一种活化性受体,可在少部分不同功能状态的CD4+T细胞表面表达。课题组前期工作发现DSS-肠炎小鼠及克罗恩病患者体内CD4+NKG2D+T细胞明显增高,为进一步探讨CD4+NKG2D+T细胞参与炎症性肠病的发病及其机制,本课题进一步深入研究DSS-肠炎小鼠及炎症性肠病患者体内增高的CD4+NKG2D+T亚群的功能及其表型特征,并对该群增高的CD4+NKG2D+T细胞亚群的特异性进行研究。研究内容分为2部分：第一部分：调节性NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞抑制DSS-诱导小鼠肠炎的活性及机制目的：明确NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞是否参与DSS-诱导小鼠肠炎的发病,比较调节性NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞与Treg、NK1.1+CD4+NKG2D+T细胞的生物学特性,并初步探讨调节性NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞在DSS-诱导小鼠肠炎中的发病地位。方法：使用2.5%右旋葡聚糖硫酸钠(DSS)溶液诱导C57BL/6J小鼠肠炎模型,利用流式细胞术检测小鼠脾脏细胞及肠道NK1.1-CD4+NKG2D+T、CD8+NKG2D+T、 NK1.1+NKG2D+T细胞的频率变化,以及DSS-诱导肠炎小鼠和对照组小鼠NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞表面CD62L、CD44、CD25、FasL、CD223 (LAG-3)、CD69、 CD39、CTLA-4、GITR的表达。使用胞内染色法流式检测该细胞亚群胞浆内IFN-γ、IL-17、 IL-10、TGF-β、颗粒酶B、穿孔素分泌情况及核内转录因子Foxp3、T-bet、ROR-γt、 GATA-3转录情况。利用流式细胞术检测NK1.1-CD4+NKG2D+T、NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞表面2B4、NKG2A、NKp46、Ly49D、Ly49H、KLRG1的表达情况。利用尾静脉注射过继输入NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞观察其参与肠炎发病地位。利用免疫荧光染色检测DSS肠炎小鼠肠道上皮细胞及DC细胞表面RAE-1表达情况,并利用统计学分析其与肠道内NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞频率之间的相关性。利用CD107a标记法检测CD4+NKG2D+T细胞对B16-MICA有无杀伤活性。使用RT-PCR对NK1.1-CD4+NKG2D+T、NK1.1+CD4+NKG2D+T细胞转录谱进行分析。结果：DSS-诱导肠炎小鼠脾脏较对照组NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞频率增高,CD8+NKG2D+T细胞、NK1.1+NKG2D+T细胞的频率降低；而DSS-诱导肠炎小鼠肠道较对照组NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞频率降低,CD8+NKG2D+T细胞、NK1.1+NKG2D+T细胞的频率增高。过继输入NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞后可以抑制小鼠肠炎发病,加入阻断TGF-β的抗体后,过继输入NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞抑制肠炎小鼠发病的效应降低。DSS-诱导肠炎小鼠脾脏NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞高分泌TGF-β,表面高表达FasL, (?)低分泌IFN-γ、IL-17,胞浆内无颗粒酶B、穿孔素分泌,脱颗粒方面不表达CD107a,不具有细胞毒活性。NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞主要为效应记忆型T细胞,低表达CD39及CD69等活化分子,不表达CD25、CD223 (LAG-3)、CTLA-4、GITR等。NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞不同于Treg细胞,不表达CD25、GITR,不转录Foxp3。 DSS诱导肠炎小鼠脾脏NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞不表达2B4、NKG2A、NKp46、Ly49D、Ly49H、KLRG1,而NK1.1+CD4+NKG2D+T细胞较野生型小鼠高表达NK细胞表面受体NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞胞浆内低表达转录因子T-bet,不转录RORγt、Foxp3、GATA-3等转录因子。最后RT-PCR结果显示NK1.1+CD4+NKG2D+T细胞与NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞转录谱明显不同。结论：DSS-诱导肠炎小鼠体内出现一群增高的特异性的调节性NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞,该群处于活化状态的调节性NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞不同于经典的Treg细胞、NK1.1+CD4+NKG2D+T,主要通过分泌TGF-β及FasL发挥免疫调节功能,抑制肠炎小鼠发病。第二部分：CD4+NKG2D+T细胞在IBD和结肠癌中的分布及其生物学特性目的：研究CD4+NKG2D+T细胞在克罗恩病、溃疡性结肠炎、结肠癌患者外周血频率变化及功能、表型特点,并评价其参与疾病功能。方法：通过流式细胞术检测克罗恩病、溃疡性结肠炎、结肠癌患者、健康人外周血CD4+NKG2D+T、CD8+NKG2D+T、CD56+NKG2D+T细胞频率变化,进一步明确克罗恩病及结肠癌患者体内CD4+NKG2D+T细胞表面CD28、CD69, CD39表达情况,利用胞内染色流式检测CD4+NKG2D+T细胞亚群胞内细胞因子IFN-γ、TGF-β、IL-17分泌情况。比较克罗恩病及结肠癌患者体内CD4+NKG2D+T细胞表面CD56、CD28表达情况。结果：克罗恩病患者外周血CD4+NKG2D+T细胞频率较溃疡性结肠炎明显升高,而CD8+NKG2D+T、CD56+NKG2D+T细胞频率无明显差异。克罗恩病患者外周血CD4+NKG2D+T细胞高分泌IFN-γ、IL-17,低分泌TGF-β,该T细胞亚群表面低表达CD28,高表达CD69、CD39,处于活化状态。结肠癌患者较健康人外周血CD4+NKG2D+T细胞频率升高。结肠癌患者体内升高的CD4+NKG2D+T细胞高表达CD28、CD69. CD39,处于活化状态,且高分泌TGF-p,低分泌IFN-γ、IL-17。克罗恩病患者外周血CD4+NKG2D+T细胞较结肠癌患者高表达CD56,低表达CD28。结论：克罗恩病及结肠癌患者体内存在一群增高的CD4+NKG2D+T细胞,克罗恩病患者体内增多的CD28dimCD56+CD4+NKG2D+T细胞主要通过分泌IFN-γ、IL-17发挥炎性作用,结肠癌患者体内增多的CD28highCD56-CD4+NKG2D+T细胞主要通过分泌TGF-β发挥免疫调节功能。两种不同表型的CD4+NKG2D+T在不同疾病中发挥不同的功能特点。