酵母RPD3S复合物和果蝇ORC复合物的昆虫表达体系构建、亚基的表达纯化和晶体生长尝试

来源 :中国科学院研究生院 中国科学院大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:felixzhu2005
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RPD3S复合物由5个亚基组成,是细胞体内重要的去乙酰化酶,参与基因组转录的调控。RPD3S复合物中的SIN3蛋白起着支架蛋白的作用,RCO1蛋白可以协助EAF3识别组蛋白H3上甲基化的第36位赖氨酸残基,从而把复合物带到基因转录区让RPD3S行使去乙酰化酶的功能,从而有效避免基因转录区的内部转录。然而另一个亚基UME1的功能尚无明确定论,PDB结构数据库中也缺乏UME1的同源结构。本文在原核细胞中表达纯化了UME1蛋白,并进行了晶体生长的尝试。RCO1和EAF3的协同作用已经通过缺失突变的方法在功能水平得到了证实,本文通过体外实验进一步证实了这两个蛋白的相互作用。此外,本文还构建了RPD3S复合物的昆虫表达体系,纯化结果证明了该体系可以高效表达该复合物。   复制起始位点识别复合物(ORC)由六个异源亚基组成,是调控DNA复制起始的关键蛋白,在基因转录沉默、姐妹染色体粘连、细胞周期调控等细胞过程中也起着重要作用。本文构建了果蝇ORC复合物的昆虫表达体系,并且通过western检测验证了果蝇ORC的表达。由于果蝇ORC3缺乏同源结构、拥有很长的功能未知区却参与嗅觉记忆等重要过程,本文设计了一系列的截短,并纯化获得了较高纯度的截短体蛋白为深入的研究提供基础。   本文构建了有效的RPD3S复合物和ORC复合物的昆虫表达体系,并纯化获得高纯度的UME1、EAF3和ORC3等亚基并尝试了晶体条件的筛选,进一步的筛选实验仍在继续中。RPD3S复合物和ORC复合物都是细胞内的关键蛋白但都还缺乏结构信息,UME1、ORC3都是不可或缺的亚基但都缺乏明确的功能信息,结构的解析将有助于我们更深刻地理解这些复合物和亚基的生物学功能。
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