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卵巢癌是妇科三大恶性肿瘤之一，死亡率居首位。卵巢癌发病隐匿，早期无明显症状，又缺乏有效的筛查手段，往往发现时已是晚期。多年来卵巢癌5年生存率一直徘徊在30％以下[1]，如果卵巢癌能够早期发现并治疗，其5年生存率可以提高到70～90％[1,2]。因此，为寻求有效的早期诊断和治疗方案，卵巢癌发生、发展的机制一直是妇科肿瘤基础与临床研究探索的重点。 人附睾蛋白4(human epididymis protein4，HE4)是一种小分子分泌型糖蛋白，从1991年发现至今，大量的临床流行病学研究证实HE4对卵巢癌的早期诊断、疗效检测和预后评估具有重要价值，其敏感度和特异性优于经典的卵巢癌标记物CA125[3-5]。然而，作为一种新型的肿瘤标志物，其表达增加的意义及机制还不清楚。目前有关HE4基因和蛋白功能的研究正在成为热点。LeBleu VS等[6]以肾纤维化转基因小鼠为模型，首次证实了HE4具有蛋白酶抑制剂的功能，拓展了人们对HE4功能的认识。然而对于HE4参与卵巢癌发生发展的机制研究很少。本课题组利用基因重组技术构建了HE4基因的原核表达载体，成功表达并获得了较高纯度的重组HE4蛋白。为今后检测HE4的互作蛋白、受体蛋白奠定基础。我们同时购买了真核表达的重组HE4蛋白进行体外实验。我们以卵巢腺癌细胞系SKOV-3作为模式细胞，将HE4蛋白作用于细胞，结果显示，经HE4蛋白处理后，SKOV-3细胞的恶性生物学行为明显增强，如细胞增殖能力增强，进入G2/M期的细胞比例明显增加。我们在实验中意外发现，HE4蛋白处理后，SKOV-3细胞对化疗药卡铂的耐药性增强。通过检测凋亡因子Bcl-2和Bax蛋白的表达水平，我们推断，HE4对细胞耐药行为的影响可能是通过调控Bcl-2家族成员的表达而实现的。我们进一步利用基因芯片技术筛选HE4处理前后SKOV3细胞的差异表达基因，发现细胞对HE4蛋白的应答基因涉及广泛的功能，包括周期调节，信号转导，细胞增殖，凋亡，DNA修复，应激反应等。本研究有助于全面了解细胞对HE4蛋白的应答机制，以期为卵巢癌特殊生物学行为和耐药机制研究提供新的思路。 全文分下列两部分: 第一部分重组HE4蛋白的原核表达和纯化 目的: 重组及表达HE4融合蛋白。 方法: 以合成pcDNA3.1-HE4质粒为模板，用带NcoⅡ/NotⅠ双酶切位点的引物进行PCR扩增，将产物HE4片段与pET28a载体连接，转化入DH5a菌中进行克隆并测序鉴定。进一步构建pET28a-HE4表达体系，用异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，在BL21菌中表达HE4融合蛋白(含有His-Tag)。蛋白经Ni2+-NTA层析柱纯化后，进行SDS-PAGE分析鉴定。 结果: 1、成功构建了HE4融合蛋白的重组表达质粒。 2、在大肠杆菌中实现了HE4重组蛋白的可溶性高表达。 结论: 采用原核表达方法可获得较高纯度的HE4融合蛋白，为进一步研究HE4的生物学功能奠定基础。 第二部分 HE4蛋白对人卵巢癌细胞系SKOV3生物学特性的影响及其机制研究 目的: HE4作为一种新型的肿瘤标志物已经广泛应用在卵巢癌的诊断中。本实验拟探讨其对卵巢癌细胞系SKOV-3的生物学表型的影响及其作用机制。 方法: 检测重组HE4蛋白处理后， SKOV3细胞增殖、周期分布和凋亡细胞比例的变化，并通过基因芯片技术探讨HE4处理前后卵巢癌细胞相关基因的表达差异。 结果: 1、重组HE4蛋白刺激后SKOV3细胞的恶性生物学行为明显增强，细胞增殖能力增强，G2/M期的细胞比例明显增加。细胞对化疗药卡铂的耐药性也增强。 2、基因芯片筛选出众多差异表达基因，细胞对HE4蛋白的刺激的应答基因涉及广泛的功能，包括周期调节，信号转导，细胞增殖，凋亡，DNA修复，应激反应等。 结论: HE4蛋白通过调控一众下游基因的表达，在促进卵巢癌细胞恶性生物学行为的过程中发挥重要作用。