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逍遥散出自《太平惠民和剂局方》,由柴胡30g、当归30 g、茯苓30 g、白芍30g、白术30g、炙甘草15g、薄荷10g、生姜10g组成,是治疗抑郁症最常用的经典名方之一,临床及实验研究均证明该方有确切的抗抑郁作用,但是由于抑郁症本身的病因、病机比较复杂,再加上逍遥散处方组成复杂,内在药效物质基础和抗抑郁机理没有完全阐明,为质量控制带来很大的困难。为阐明其物质基础,并进一步研发新型的高效低毒抗抑郁新药,本课题针对逍遥散进行抗抑郁的活性组分的初步筛选研究。研究内容和结果如下: 首先将逍遥散处方作为一个整体分成若干组分,经提取后分别采用大孔树脂柱分离和系统溶剂萃取法分离,并用HPLC指纹图谱表征各组分的化学物质,评价分离效果,结果表明大孔树脂柱分离得到的各组分化学交叉较少,该方法将作为本研究的分离手段。 其次,采用体外脑内单胺类神经递质—5羟色胺(5—HT)、去甲肾上腺素(NA)、多巴胺(DA)的再摄取抑制实验,分别以经典抗抑郁西药氟西汀、地西帕明、6—羟多巴为阳性对照,通过抑制率评价逍遥散分离组分对脑内单胺类神经递质再摄取抑制的活性,从分子水平上筛选抗抑郁药效组分。在5—HT再摄取抑制实验中组分A对5—HT的抑制率(以氟西汀对5-HT的抑制率100%计)达到80%,组分B3对5—HT的抑制率为41%,逍遥散原方对5-HT抑制率为41%;在NA再摄取抑制实验中组分A对NA的抑制率(以地西帕明对NA的抑制率100%计)达到119%,组分B3对NA的抑制率达到116%,逍遥散原方对NA的抑制率为46%;在DA再摄取抑制实验中所有分离组分对DA的再摄取抑制效果很微弱。该实验得出结论:组分A和B3对5—HT再摄取抑制活性强于原方;组分A和B3对NA再摄取抑制活性强于原方,并且优于西药地西帕明;A的总体抑制效果优于B3。 然后选用经典行为学绝望模型(小鼠悬尾和小鼠游泳)对体外筛出的最佳有效组分A进行体内抗抑郁活性验证,并寻找最佳有效剂量,结果显示:组分A能明显缩短小鼠悬尾和游泳的不动时间,在体内表现出较强的抗抑郁活性,验证了体外活性筛选的结果,并且确定了最佳有效剂量为240mg/Kg(相当于46g生药材/Kg)。 参考体外筛选和组分A的体内的实验结果,将其余各分离组分适当组合,用小鼠悬尾验证其体内药效活性,结果B3表现出了抗抑郁活性,其余各组分及其组合几乎无活性,与体外筛选的结果基本一致。 为了确保实验的可靠性,最后采用目前公认的经典抑郁模型—慢性不可预知应激刺激模型(CUMS)通过行为学结果进一步确证各组分的活性,该实验分为9个组,分别为模型组,空白组,逍遥散复方水煎液组、逍遥散散剂组、逍遥散分离组分A、B1、B2、B3和C组,造模21天,行为学结果显示造模成功。组分A第21天的行为学数据与模型组比较除了水平格和理毛时间是显著性差异(P<0.05),其它指标(不动时间,垂直运动,糖水偏爱)都是极显著性差异(P<0.01),说明A的抗抑郁活性很明显;B3组的行为学数据与模型组比较无显著性差异,在CUMS实验中B3没有表现出明显抗抑郁活性。该实验得出结论:A具有较好的抗抑郁活性,效果优于传统水煎剂,B2和B3组分几乎无抗抑郁活性,B1和C组分无抗抑郁活性。 体外、体内活性筛选及CUMS抑郁模型都证明了组分A具有明显抗抑郁活性,最后采用HPLC组分A的指纹图谱,得到20多个共有峰,并对其中的某些峰进行了药材归属;并用该方法对10批A样品的制备工艺稳定性进行考察,结果显示10批样品的相似度较高,说明组分A的制备工艺稳定。 结论:通过体外和体内多种模型最终筛选出具有抗抑郁活性的组分A和活性有待进一步验证的B3组分,其中A在各个实验中表现出的活性高于B3和原方,这两个组分都是极性相对较小的物质群;建立了A组分的HPLC指纹图谱方法并确定了其制备工艺。