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亚铁血红素氧化酶Ⅰ(heme oxygenasel,Hoxl)和藻蓝素铁氧还蛋白还原酶(ferredoxin oxidoreductase,PcyA)是藻蓝胆素(PCB)合成过程中的关键酶,它们表达的两个酶催化血红素(heme)转化为藻蓝胆素,控制这两个酶合成的基因分别是亚铁血红素氧化酶Ⅰ基因(hoxl)及藻蓝素铁氧还蛋白还原酶基因(pcyA)。藻蓝蛋白裂合异构酶E和F(cpcE/F)负责催化PCB与脱辅基蛋白的连接。只有结合了色基,藻蓝蛋白才能具有光学活性。随着藻蓝蛋白越来越广泛的应用于生产生活中,有关hoxl基因和pcyA基因的克隆及序列功能分析成为藻蓝蛋白研究中的热点课题。
本实验应用降落PCR方法从聚球藻Synechococcus cedrorum中扩增出717bp的hoxl基因全序列,并与从GenBank下载13个蓝藻hoxl基因序列比较,用MEGA4.0进行序列同源性分析及蛋白结构特性分析。结果表明,Synechococcus cedrorum的hoxl基因与聚球藻Synechococcus PCC7942和钝顶节旋藻Arthrospira platensis的hoxl基因序列同源性分别为99.9％和99.2％,氨基酸序列同源性分别为99.6％和97.9％。还用邻接法和最大简约法构建了系统树并进行了聚类分析。
运用PCR技术从钝顶节旋藻藻株Arthrospira platensis FACHB314中克隆得到747bp的pcyA基因全序列,并与从GenBank下载3个蓝藻pcyA基因序列比较,用MEGA4.0进行序列同源性分析及蛋白结构特性分析。结果表明,Arthrospira platensis FACHB314的pcyA基因与集胞藻Synechocystis sp.PCC 6803的相似性最高达到99.9％,氨基酸序列同源性为99.6％。
运用In-FusionTM试剂盒构建了pUC18-H-P质粒和pSB130-H-P重组质粒,PCR法和双酶切鉴定结果显示:表达载体pUC18-H-P质粒和pSB130-H-P质粒已构建成功。