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实验目的：细菌性脑膜炎是儿童时期较严重的神经系统感染性疾病，近年来，尽管以抗生素为主导的治疗手段使细菌性脑膜炎预后已大为改观，但是该病目前仍有较高的死亡率和致残率，因此进一步研究细菌性脑膜炎的免疫病理机制，寻找新的干预手段意义重大。细菌性脑膜炎最显著的病理特征之一是由于外周血大量的炎症细胞在趋化因子的作用下，穿越血脑屏障，向脑内迁移和聚集。因此，炎性趋化因子在介导细菌性脑膜炎的免疫炎症反应中发挥举足轻重的作用。角蛋白趋化因子（Keratinocytechemoattractant，KC）和巨噬细胞炎症蛋白2（Macrophage-inflammatory protein2，MIP-2）是CXC类趋化因子中的重要成员，在机体免疫炎症反应中发挥重要的作用。协同信号分子是介导抗感染免疫应答过程的重要成分，B7同源性3（B7Homology3，B7-H3）是B7家族的新成员，其在抗感染免疫应答中发挥着重要的免疫调控作用。本研究在我们前期发现细菌性脑膜炎患儿体内可溶性B7-H3分子异常高表达的基础上，通过体内外实验观察B7-H3对细菌性脑膜炎动物模型中趋化因子KC、MIP-2及TLR2（Toll-like receptor2）蛋白表达的影响，探讨B7-H3在细菌性脑膜炎炎症趋化作用的影响，了解其在细菌性脑膜炎病情进展中的作用，以期为细菌性脑膜炎的免疫干预提供新的思路和实验依据。实验方法：1、体内试验，研究B7-H3对肺炎链球菌脑膜炎小鼠神经行为学改变、体质量的变化和脑组织匀浆中趋化因子KC、MIP-2mRNA相对表达量及TLR2蛋白的表达的影响。取月龄为1.5-2月的健康雄性BALB/C小鼠48只，随机分为4组：生理盐水对照组（CON组）、B7-H3组（B7-H3组）、肺炎链球菌组（SP组）、肺炎链球菌+B7-H3蛋白组（SP+B7-H3组）；每组12只小鼠。腹腔注射诱导麻醉后，通过侧脑室定位注入10μl无菌生理盐水+5μl肺炎链球菌混悬液来建立小鼠细菌性脑膜炎模型；CON组注射15μl无菌生理盐水，B7-H3组注入10μlB7-H3蛋白+5μl无菌生理盐水，SP组注入10μl无菌生理盐水+5μl肺炎链球菌混悬液，SP+B7-H3组注入10μlB7-H3蛋白+5μl肺炎链球菌混悬液。分别于侧脑室注射后6h、24h对各组小鼠进行：1)神经行为学评分、2)记录体质量的变化、3)HE染色方法观察脑组织炎症状况、4)Real-time PCR方法检测脑组织中趋化因子KC、MIP-2mRNA的相对表达量、5)免疫组织化学方法检测大脑皮层中TLR2蛋白的表达。2、体外实验，研究B7-H3对肺炎链球菌感染条件下小胶质细胞培养上清液中趋化因子KC、MIP-2表达的影响。选用生后1-3天的BALB/C新生小鼠，无菌条件下取脑组织，经分离、培养、纯化后获得原代小胶质细胞，接种于24孔培养板中，细胞密度为1×105/孔。实验分组：对照组（CON组）、肺炎链球菌感染组（SP组）、肺炎链球菌+B7-H3蛋白组（SP+B7-H3组）,三组细胞体系中均加入等量的头孢曲松(浓度为100μg·ml-1)以抑制细菌的过度繁殖。分别在刺激后5h、24h、48h收集细胞培养上清液，用ELISA方法检测上清液中趋化因子KC、MIP-2的浓度变化。实验结果：一、体内试验1、神经行为学评分：各组小鼠侧脑室注射后6h、24h后进行神经行为学评分，B7-H3组与CON组相比6h（5.0±0）vs（5.0±0）、24h（5.0±0）vs（5.0±0），差别无统计学意义（P>0.05）；SP组评分相对CON组明显降低6h（3.67±0.52）vs（5.0±0）、24h（2.0±0.63）vs（5.0±0），差异具有统计学意义（P<0.05）；而SP+B7-H3组相比SP组评分更低6h（2.83±0.75）vs（3.67±0.52）、24h（1.17±0.41）vs（2.0±0.63），差异具有统计学意义（P<0.05）。2、体质量变化比较：分别记录各组小鼠侧脑室注射前和注射后6h、24h体质量的变化，B7-H3组与CON组相比6h（0.06±0.27）vs（0.11±0.59）、24h（0.92±0.8）vs（0.04±0.93），差别无统计学意义（P>0.05）；SP组体质量相对CON组降低明显6h（0.99±0.21）vs（0.11±0.59）、24h（2.3±0.39）vs（0.04±0.93），差异具有统计学意义（P<0.05）；而SP+B7-H3组相比SP组体质量明显下降6h（1.51±0.44）vs（0.99±0.21）、24h（2.68±0.18）vs（2.3±0.39），差异具有统计学意义（P<0.05）。3、脑组织HE染色：在6h时，SP组相对于CON组软脑膜血管充血明显，蛛网膜下腔显著扩张，脑膜及蛛网膜下腔有炎症细胞浸润；SP+B7-H3组相对于SP组软脑膜血管充血更加显著，蛛网膜结构完整性破坏，蛛网膜下腔开放，脑膜及蛛网膜下腔大量炎症细胞浸润。24h时，SP组相对于CON组软脑膜血管充血较前明显，蛛网膜下腔显著扩张，脑膜及蛛网膜下腔有炎症细胞浸润，SP+B7-H3组相对于SP组软脑膜血管充血更加显著，蛛网膜结构完整性极度破坏，蛛网膜下腔开放，脑膜及蛛网膜下腔炎症细胞浸润加剧并伴有炎症细胞向蛛网膜下腔外迁移。4、脑组织匀浆Real-time PCR检测KC、MIP-2mRNA相对表达量：在细菌注射6h后，SP组KC mRNA的相对表达量相对于CON组明显升高（13.48±1.056）vs（1±0.078），差异有统计学意义（P<0.05）； SP+B7-H3组KC mRNA的相对表达量与SP组相比明显升高（16.92±7.461）vs（13.48±1.056），差异具有统计学意义（P<0.05）；24h时SP组KC mRNA相对表达量较CON组明显升高（16.19±1.766）vs（1±0.236），差异具有统计学意义（P<0.05），SP+B7-H3组KC mRNA的相对表达量与SP组相比明显升高（80.33±47.595）vs（16.19±1.766），差异具有统计学意义（P<0.05）；在细菌注射后6h，SP组MIP-2mRNA相对表达量较CON组升高（1.21±0.932）vs（1.01±0.008），差异无统计学意义（P>0.05），SP+B7-H3组MIP-2mRNA的相对表达量与SP组相比有升高（1.24±0.804）vs（1.21±0.932），但差异无统计学意义（P<0.05）；24h时SP组MIP-2mRNA相对表达量较CON组明显升高（12.88±7.792）vs（1.00±0.091），差异具有统计学意义（P<0.05），SP+B7-H3组MIP-2mRNA的相对表达量与SP组相比明显升高（38.76±6.061）vs（12.88±7.792），差异具有统计学意义（P<0.05）5、脑组织免疫组化结果分析：三组脑膜炎小鼠脑组织胞膜和胞浆上均可见TLR2棕黄色阳性颗粒，6h、24hCON组TLR2有少量表达；SP组6h时表达开始上调（32.67±3.93）vs（1.00±0.63），24h时表达明显增多（59.83±12.12）vs（2.16±0.75），各时间点与CON组比较明显增高（P<0.01）；SP+B7-H3干预组TLR2的表达较SP组进一步增高6h（50.5±8.73）vs（32.67±3.93）、24h（86.33±3.2）vs（59.83±12.12），差异具有统计学意义（P<0.05）。二、体外实验1、SP组在细菌刺激后5h、24h、48h时，小胶质细胞培养上清中趋化因子KC的浓度明显升高于CON组（219.19±139.87）vs（18.44±16.32），（P<0.05）；（2883.38±1957.20）vs（44.96±25.73），（P<0.05）；（4883.44±1062.75）vs（169.64±86.95）pg·ml-1，（P<0.05）; SP+B7-H3组在刺激后5h、24h、48h与SP组相比，KC的浓度均进一步显著上升（1460.16±553.44）vs（219.19±139.87），（P<0.05）；（6993.51±4869.28）vs（2883.38±1957.20），（P<0.05）；（10394.47±6012.32）vs（4883.44±1062.75） pg·ml-1，（P<0.05）。2、SP组在刺激后5h、24h、48h时趋化因子MIP-2的表达明显升高于CON组（324.60±2.29）vs（279.87±10.15），（P<0.05）；（340.00±23.38）vs（287.78±9.89），（P<0.05）；（907.81±72.65）vs（288.66±13.50）pg·ml-1，（P<0.05）; SP+B7-H3组在刺激后5h、24h、48h与SP组相比，MIP-2的表达均显著上升（351.91±27.15）vs（324.60±2.29），（P<0.05）；（398.88±6.76）vs（340.00±23.38），（P<0.05）；（1483.75±211.50）vs（907.81±72.65）pg·ml-1，（P<0.05）。结论：1、本实验经侧脑室注射肺炎链球菌混悬液，成功建立了小鼠肺炎链球菌性脑膜炎模型。2、体内外实验结果证实，趋化因子KC、MIP-2及TLR2蛋白在肺炎链球菌脑膜模型中表达量升高，趋化因子及TLR2参与了脑膜炎病理损伤和免疫炎症反应过程。3、协同信号分子B7-H3加剧了细菌性脑膜炎病情的进展，促进脑组织免疫炎症反应，使趋化因子KC、MIP-2及TLR2的表达量进一步升高，表明B7-H3加剧了肺炎链球菌脑膜炎的病理损伤，增强了炎症趋化作用。