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应用山羊IgG免疫性成熟的红笛鲷,人工催产孵化出仔鱼后,建立了间接双抗体夹心法检测仔鱼特异性抗体的降解过程,从红笛鲷仔鱼匀浆液中分离纯化了仔鱼特异性抗体,并对其理化特性进行了分析,同时探讨了受免红笛鲷亲鱼血清抗体的变化规律。为阐明红笛鲷母源抗体的垂直转移机理打下理论基础,并为通过免疫亲鱼来提高仔鱼的抗病力开辟了新的途径。
在红笛鲷亲鱼产卵前两个月开始对其进行注射免疫,免疫结束后人工催产进行孵化。取早期仔鱼匀浆,用双抗体夹心法来检测仔鱼特异性抗体的降解动力学。确立的最佳优化条件为:山羊IgG包被浓度为1.563μg/mL,兔抗红笛鲷IgM 血清的稀释度为1:800,辣根过氧化酶标记山羊抗兔IgG的稀释度为1:2000;0.01mol/L pH7.4的PBST作稀释液,底物最佳反应时间为20min。
对红笛鲷仔鱼特异性抗体进行检测。发现仔鱼特异性抗体水平随时间变化呈下降趋势且可以在仔鱼体内持续七天,每尾仔鱼特异性抗体降解量约0.001μg,最低检测限为0.482μg/mL;而对照组仔鱼体内则检测不到特异性抗体。采用饱和硫酸铵分步盐析与亲和层析二步纯化红笛鲷仔鱼特异性抗体,结果显示,盐析仔鱼特异性抗体最理想的硫酸铵饱和度为40~50%;亲和层析分离到两个明显独立的层析峰。SDS-PAGE证明纯化的抗体具有极高纯度,其L、H链分子量分别为29 kDa和77.5 kDa,推测仔鱼特异性抗体分子量约为852 kDa。该抗体不仅能够与山羊IgG产生特异性免疫反应,而且能与兔抗红笛鲷IgM抗血清产生免疫反应,因而认为红笛鲷母源抗体可以垂直转移至仔鱼。
用ELISA检测亲鱼血清抗体效价变化规律,以山羊IgG作为包被抗原,用正常红笛鲷亲鱼血清抗体作第一抗体时,能检测到一定水平的免疫反应,说明正常红笛鲷体内就存在该特异性抗体;以山羊IgG免疫的红笛鲷亲鱼血清作第一抗体时,ELISA反应强度显著提高,血清抗体效价至少为1:2048。并且发现免疫组红笛鲷亲鱼受抗原刺激后,第2周时已产生特异性抗体,第八周时抗体达最高水平,此后逐渐减低,但第16周时仍维持在较高的水平。