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GnIH（Gonadotropin-inhibitory hormone，促性腺激素抑制激素）是一种位于下丘脑的神经肽，鸟类和哺乳类的研究显示其主要是在生殖中起负向调控的作用。鱼类中关于GnIH功能和调控的研究报道非常少，而且存在不一致的研究结果，为了弄清GnIH在鱼类生殖中的作用和受到的调控作用，我们以鲤为材料获得了鲤GnIH及其三种受体的cDNA全长，检测了鲤生殖过程中GnIH/GnIHRs在下丘脑-垂体-性腺轴(hypothalamus-pituitary-gonad，HPG)的表达变化。通过序列分析，我们合成了鲤GnIH-Ⅲ多肽进行了体内注射及体外孵育垂体组织实验。通过转录因子结合位点分析，发现GnIH启动子序列上存在许多雌激素受体和肾上腺素受体结合位点。我们制备了能准确标记内源GnIH神经元的转GnIH启动子斑马鱼Tg（GnIH: mCherry），同时我们也运用TALENs技术得到了雌激素受体Esr2b突变的斑马鱼系，在此基础上研究了雌激素和肾上腺素对于GnIH的调控作用。取得的主要研究结果如下: 一，GnIH在鲤生殖过程中的作用研究 (1)通过5Race和3Race获得了鲤GnIH及其三种受体GnIHRs(GnIHR1/2/3)的cDNA全长。鲤的GnIH/GnIHRs序列与斑马鱼、金鱼相似度很高，和其他鱼类（星点东方纯、罗非鱼）差异比较大。鲤的GnIH前体cDNA序列可能编码三种GnIH多肽（GnIH-Ⅰ、GnIH-Ⅱ、GnIH-Ⅲ）。qPCR的结果显示GnIH/GnIHRs广泛存在于HPG轴(hypothalamus-pituitary-gonad)，其中GnIH与GnIHR1在下丘脑和性腺表达，但不在垂体表达。GnIHR2和GnIHR3存在于整个HPG轴。 (2)qPCR检测了鲤生殖过程中下丘脑GnIHmRNA含量的变化，发现GnIH在生殖高峰到来时表达水平显著下降，达到最低值，但生殖后表达水平上升，与GnRH3和LH的表达模式完全相反。我们还检测了GnIHRs在鲤生殖过程中HPG轴各个层面的表达变化，GnIHRs在下丘脑表达模式与GnIH相似，在生殖高峰期下降。在垂体中，GnIHR2/3在生殖前达到最高值，在生殖高峰期显著下降。在性腺中，GnIHR1的表达在生殖高峰达到最低值，而GnIHR2/3则在此时达到最高值。 (3)我们用合成GnIH-Ⅲ多肽分别进行了体内注射成熟鲤和体外孵育鲤垂体组织实验，发现其能显著抑制GtH mRNA的表达，而且，LHRH+DOM对LHβmRNA的促进作用也被GnIH-Ⅲ多肽所抑制。 二，雌激素和肾上腺素对斑马鱼GnIH的调控作用 (1)GnIH在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达模式。我们通过原位杂交技术检测了GnIH在斑马鱼胚胎发育过程中的表达。从24 hpf至72 hpf，GnIH特异的在斑马鱼头部对称表达，未在其他位置观察到杂交信号。双色原位杂交显示，GnIH与Hcrt的表达位置接近，位于斑马鱼的下丘脑侧部。 (2)GnIH启动子序列分析。通过启动子活性区域检测，我们发现GnIH启动子长度约为2.4 kb(-2357 to+50)区段能有效特异地驱动红色荧光标记。该区段包括GnIH基因上游2357 bp的序列及第一外显子上50 bp的序列。而启动子上600bp(-2357 to-1733)的序列是能驱动红色荧光特异表达的关键序列。我们利用JASPAR和TRANSFAC数据库，分析了整个2.4 kb（-2357 to+50）左右的启动子序列上可能存在的转录因子结合位点，结果发现GnIH启动子上有12个雌激素受体结合位点及24个肾上腺素受体结合位点。 (3)转基因斑马鱼Tg(GnIH: mCherry)的制备。我们将长度为2.4kb(-2357to+50)启动子克隆进入两端带有Toll2序列和插入序列后带有红色荧光标记mCherry的质粒中。将构建好的质粒和Toll2酶共注射到斑马鱼一细胞期胚胎。注射三天后筛选带有特异红色荧光标记的斑马鱼胚胎养至成熟，再与野生型斑马鱼测交得到F1代，筛选F1代中带有特异红色荧光标记的斑马鱼胚胎养至成熟，再与野生型斑马鱼测交获得F2代，继续筛选F2中带有特异红色荧光标记的斑马鱼，自交获得有纯合子的F3代。 (4)雌激素受体Esr2b突变斑马鱼系的获得。我们运用TALENs技术对Esr2b基因进行了基因编辑，突变位点位于Esr2b基因的第二外显子，起始密码子ATG后面。获得了相对于野生型胚胎少16个bp序列的Esr2b突变斑马鱼系，该类型突变无法正常翻译Esr2b蛋白。 (5)雌激素和肾上腺素对GnIH的调控作用。为了检测雌激素和肾上腺素对于GnIH表达的影响，我们用雌二醇和地塞米松（肾上腺糖皮质激素一种）处理野生型斑马鱼、转基因斑马鱼和Esr2b突变的斑马鱼胚胎，处理从2 dpf持续至4 dpf。发现10μM的雌激素能显著促进野生型斑马鱼、转基因斑马鱼和Esr2b突变的斑马鱼胚胎GnIH的表达，50μM浓度的雌二醇对野生型斑马鱼、转基因斑马鱼胚胎的GnIH的表达量影响不明显。但是，50μM的雌二醇却能显著地提高Esr2b突变斑马鱼胚胎的GnIH的表达水平。我们也用了三种浓度的地塞米松（1μM、10μM、100μM）处理斑马鱼胚胎，处理从2 dpf持续至4 dpf，三种浓度的地塞米松均能显著地提高GnIH的表达。 (6)Esr2b突变对于GnIH表达的影响。Esr2b突变的斑马鱼胚胎与野生型相比，GnIH的表达量在2dpf和3dpf没有显著差异，但是从第四天开始，Esr2b突变斑马鱼胚胎GnIH的表达量显著高于野生型胚胎的GnIH表达量。也就是说，Esr2b负责负向调控GnIH的表达，但这种调控联系发生在胚胎发育开始的第四天。 (7)Esr2b突变对斑马鱼发育及雌雄比例的影响。Esr2b突变的斑马鱼胚胎相对于野生型斑马鱼早期发育滞后，vtg1基因在Esr2b突变斑马鱼胚胎中不能被雌二醇诱导表达，这表明Esr2b突变可能会导致雌鱼卵质量下降。同时，Esr2b突变后斑马鱼后代中雌雄比例出现异常，雄鱼与雌鱼比例大于7∶1。Esr2b突变斑马鱼的雄性化倾向可能与Cyp19a1b的表达异常有关。