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线粒体重排模型主要有4种:(1)串联重复—随机丢失模型:(2)串联重复—非随机丢失模型;(3)线粒体内或线粒体间重组模型;(4)双复制随机丢失模型。串联重复随机丢失是用来解释多细胞动物线粒体基因组中的基因重排多样性最常用模型。基因重排的初始阶段很难在自然界中观察到，因此限制了我们对于潜在的重复和丢失过程的认识。脊椎动物线粒体基因tRNA簇trnW,trnA，trnN，OL，trnC，trnY是发生串联重复的一个热点区域，习惯上称“WANCY”区，其中OL为轻链复制起点，重复后会发生基因的随机丢失，故该区域往往含有同一基因的功能序列和残基。学位申请人所属团队曾对两栖类棘腹蛙Quasipaa boulengeri的28个种群290号样本的线粒体基因组WANCY序列测序研究后，发现了线粒体基因重排的中间状态，并发现了重排后产生的四种基因排列形式，这一结果支持了串联重复-随机丢失的线粒体基因重排机制。这也为探究线粒体WANCY串联重复序列演化的过程和细节提供了一个很好的机会，为研究线粒体基因演化在丢失方面提供了基础数据。本研究对棘腹蛙49个地理种群共325号样品及其近缘种合江湍蛙2号样本的线粒体WANCY串联重复序列进行基因注释，构建相同个体线粒体3726bp蛋白编码序列基因树为参照。将线粒体WANCY序列标注到基因树上，推测节点原始WANCY序列，探究WANCY序列的演化过程及其细节，同时构建分子钟，探究WANCY串联重复序列的演化速率。并将Alignment-Free应用到棘腹蛙线粒体串联重复序列演化研究中。本研究主要内容和结论如下: 1、Alignment-Free在棘腹蛙线粒体串联重复序列分析中的应用 动物线粒体基因组发生局部串联复制后，涉及区域具有多基因拷贝、假基因化、大量插入缺失的特点，难以排序和构建基因树。而Alignment-Free方法理论上可将序列进行聚类并以树形结构直观地归纳和展示这类序列的差异，利于棘腹蛙线粒体WANCY串联重复序列演化研究工作的开展。选取研究物种棘腹蛙19号样本代表个体，以3类常用的基于七长度子序列集的Alignment-Free算法，依次设k值为4、6、8、…、20对其轻链复制起点邻近复制区域583～695bp序列进行Alignment-Free聚类。构建相同个体线粒体1518bp蛋白编码序列最大似然树为参照，计算和考查两者间拓扑结构距离和差异。所评估28种算法中，半数可在主要为8的特定k值下产生和似然树拓扑结构仅相差2个节点(11.8％)的聚类树。部分算法在不同k值下均表现不佳，较小的k值4适合解析差异程度相对较高的序列间关系。这一结果例证了动物线粒体重复序列Alignment-Free聚类的可行性，其中的算法、七值理想组合可能适合类似系统。建议对其他类型的复制重排系统进行类似评估。 2、棘腹蛙线粒体WANCY串联重复序列类型及演化 总共来自49个地理种群共325号样品及其近缘种合江湍蛙2号样本的WANCY序列被测序。利用tRNAscan-SE v.1.21来识别tRNA基因，预测每一个tRNA基因的二级结构，并通过比对重复的tRNA基因及其残基，对WANCY序列进行基因注释。获得相同个体线粒体DNA的nad2、cox1、cytb、atp6+cox3、nad4和nad5六个基因片段共3726bp的序列，利用贝叶斯法构建基因树。结果表明:(1)在已有研究结果基础上，类型Ⅰ和类型Ⅲ均存在亚型，类型Ⅰ分3个亚型，类型Ⅰa和Ⅰb具有3个拷贝的WANCY序列，为两次独立演化;类型Ⅰa、与类型Ⅱ、Ⅲa、Ⅲb和Ⅵ相同，具有2个拷贝的WANCY序列，为一次独立演化;依据序列本身特点类型Ⅲ分为两个亚型，Ⅲa和Ⅲb;(2)基因注释及排列顺序信息反映了棘腹蛙WANCY串联重复序列的特点:发生功能缺失的tRNA分布在WANCY序列的中间，有功能基因分布于序列两端。 3、棘腹蛙线粒体WANCY串联重复序列丢失过程 在325号棘腹蛙样本的WANCY串联重复序列中共检测出189个单倍型，将这些单倍型标注到由这325号棘腹蛙样本蛋白编码序列构建的基因树上，推测节点原始WANCY序列，探究WANCY序列的丢失过程及其丢失细节，同时基于贝叶斯分析构建分子钟，探究WANCY串联重复序列的丢失速率。结果显示:(1)WANCY串联重复序列在演化过程中发生的碱基转换数量多于颠换，单个碱基的丢失数量多于插入，部分个体有大片段的插入缺失现象;虽然棘腹蛙线粒体WANCY串联重复序列序列差异性很大，但样本序列长度与各节点序列长度差值约为1bp;部分WANCY序列存在C、G的重复序列，类型Ⅰa中C的重复序列个数在4-14间，G的重复序列个数在8-15间，类型Ⅳ中G的重复序列个数在4-12间;(2)各支系发生碱基替换，插入，缺失数目有一定的差异，但就突变的位置来说，多发生在序列的中间部位，两端很少发生;(3)各支系早期/近期突变速率不同:类型Ⅰa、Ⅲa和Ⅲb明显显示出近期比早期突变率高，类型Ⅳ则与之相反，类型Ⅰc和Ⅱ串联重复序列碱基突变率由早期到近期的演化趋于平稳。