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细胞自噬(Autophagy)是真核细胞中高度保守的一种物质降解途径。在酵母中，细胞通过包裹一些蛋白质和受损细胞器等形成双层膜结构的自噬体，随后送到液泡中进行降解，从而实现物质的循环利用。细胞自噬可以分为非选择性自噬和选择性自噬，其中选择性自噬包括Cvt(Cytoplasm to vacuole targeting)途径、线粒体自噬和脂滴自噬等。在正常的生理条件下，细胞自噬以基础水平进行着，在此过程中伴随着各种选择性的降解途径，维持着细胞的正常生命活动;而在外界不利条件的刺激下(例如营养缺陷、激素处理等)，自噬过程则被进一步诱导，通过降解、回收利用胞内物质帮助细胞渡过逆境。随着研究的日益深入，人们发现高等真核生物中各种疾病的发生也与自噬相关。
转运必需内涵体分选复合物(Endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)系统是真核细胞中完成内体膜内陷以形成多泡小体(Multi-vesicular body，MVB)的分子机器。ESCRT复合体家族包括ESCRT-0，-Ⅰ，-Ⅱ，-Ⅲ，Ⅳ共5个蛋白复合物和两个泛素化辅助亚基Bro1，Doa4。不同复合体之间具有严格的上下游关系和分工。它们主要负责将泛素化的蛋白送往液泡中降解，同时，还参与细胞自噬和病毒出茅等。在ESCRT的突变体中，晚期内体无法形成MVB，并会在液泡附近形成E型结构(Class E compartment)。
目前，关于ESCRT与细胞自噬的关系的研究得到了广泛的重视。近年来有研究表明在饥饿诱导形成自噬体过程中，ESCRT通路的表达量会上调。但也有文献表示ESCRT突变体中自噬受阻可能是由于MVB形成受阻间接引起的。本文通过基因敲除、蛋白互作、荧光定位、免疫印迹等技术，重点探讨了酿酒酵母中ESCRT复合体部分亚基缺失后对非选择性自噬和脂滴自噬的影响。得到如下主要结果:
1.ESCRT-Ⅰ复合体各亚基缺失突变体中细胞自噬受阻
GFP-Atg8降解和prApe1的成熟情况可用于反映酵母中细胞自噬的水平。在饥饿诱导的细胞自噬中，ESCRT-Ⅰ复合体各亚基缺失后，GFP-Atg8不同程度呈块状堆积，不能正常进入液泡中降解，其中Vps23缺失突变体中堆积表型最为明显:整个ESCRT-Ⅰ复合体缺失的四敲突变体中自噬缺陷显著增强。
2.Vps23与Vps38、Vps15、Vps34及自噬相关蛋白Atg17、Atg20、Atg24存在互作
酵母双杂交检测到Vps23与PI3K复合体中Vps38、Vps15、Vps34存在互作，其中与Vps15的互作最强。此外，Vps23与自噬相关蛋白Atg17、Atg20、Atg24也存在较强互作。利用双分子荧光互补技术(BiFC)进一步验证了Vps23与Atg17、Atg20、Atg24之间的互作，且互作发生在在内体和自噬体组装位点(PAS)上。为了探讨这些互作与细胞自噬的关系，我们构建了双缺突变体vps23△atg17△、vps23△atg20△、vps23△atg24△，荧光观察及Westernblot定量检测GFP-Atg8的降解比例及Ape1的成熟比例，结果显示vps23△atg17△、vps23△atg20△、vps23△atg24△中自噬受阻程度显著增强。
3.互作蛋白之间的遗传互作及对彼此定位的影响
vps23△atg17△菌株中GFP-Atg8呈点状聚集在PAS上，与atg17△单敲突变体中类似，说明自噬被阻断在早期阶段:Vps23缺失对Atg17在PAS的定位没有影响，Atg17缺失会造成Vps23相对弥散。在自噬开始时，Atg17作为支架蛋白首先聚集在PAS位点，并招募其它Atg蛋白。因此我们推测，在自噬过程中Atg17很有可能直接招募Vps23进而招募其它ESCRT蛋白。
vps23△atg20△、vps23△atg24△双缺突变体中GFP-Atg8呈月牙状堆积在液泡边，与vps23△单敲菌株中类似，说明自噬体能够大量形成，自噬被阻断在后期阶段:Vps23缺失会造成Atg20、Atg24呈块状堆积在ClassE结构中，不能正常定位。反之Atg20、Atg24缺失对Vps23的定位无明显影响。Atg20和Atg24被报道参与选择性自噬Cvt途径，其中机理尚不明确。但Atg20和Atg24的缺失确实会增强vps23△菌株中的自噬缺陷，这一结果提示我们，Atg20和Atg24可能在非选择性自噬中同样发挥一定的作用。
4.ESCRT核心亚基Snf7，Vps4缺失促进脂滴自噬
脂滴中的甘油三酯(Triglycerides，TAG)可以通过自噬途径与溶酶体融合并被溶酶体内的脂肪酶水解成脂肪酸被线粒体利用，这种自噬途径被称为脂滴自噬(Lipophagy)。Atg15是酿酒酵母中的一种磷脂酶，定位于液泡内。它可以降解液泡中的自噬小体及Cvt小体。最近有文献报道Atg15同样参与脂滴自噬，其功能是降解脂滴的主要成分之一甘油三酯(TAG)，对维持胞内脂滴的循环起重要作用。
实验室前期数据表明，在ESCRT突变体中，Atg15的运输受阻，几乎全部堆积在ClassE中。因此我们很迫切地探讨ESCRT与脂滴自噬之间的关系。初步结果如下:Westernblot定量分析脂滴自噬标记蛋白Erg6的降解情况，野生型中Erg6-GFP的降解比例大约为16％，atg15△菌株的几乎不降解:而snf7△、vps4△菌株中Erg6-GFP降解比例分别高达39％、46％:双敲突变体atg15△snf7△、atg15△vps4△中Erg6-GFP同样不降解，与atg15△菌株类似。荧光观察发现snf7△、vps4△突变体中脂滴进入液泡的活细胞比例分别达到了22％、27％，远远高于野生型中的2％，这一结果与Westernblot结果比较类似。这些结果说明:ESCRT核心亚基Snf7，Vps4缺失会促进脂滴自噬。
Tg13和Tg14是酿酒酵母中的脂肪酶，可以将脂滴中的甘油三酯(TAG)降解为甘油二酯(DAG)，定位于脂滴上。snf7△、vps4△菌株中，Tg13、Tg14与脂滴的共定位比例无明显变化，Westernblot结果显示snf7△、vps4△菌株中Tg13、Tg14的蛋白水平比WT中明显降低。脂滴在细胞中运输时，与部分细胞器会有互相接触，比如线粒体，内涵体等，有人猜测这种接触可能为细胞器之间进行脂质交换提供便利。在诱导脂清自噬条件下，野生型中脂滴与晚期内涵体的共定位比例高达68％，而vps4△突变体中共定位比例仅有26％。这说明，ESCRT突变体中脂滴不能正常与晚期内涵体正常接触。
以上结果初步表明ESCRT复合体参与了非选择性自噬和脂滴自噬，这些结果为阐释ESCRT系统在非选择性自噬和脂滴自噬中的调控机制提供了重要的理论与实验依据。
转运必需内涵体分选复合物(Endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)系统是真核细胞中完成内体膜内陷以形成多泡小体(Multi-vesicular body，MVB)的分子机器。ESCRT复合体家族包括ESCRT-0，-Ⅰ，-Ⅱ，-Ⅲ，Ⅳ共5个蛋白复合物和两个泛素化辅助亚基Bro1，Doa4。不同复合体之间具有严格的上下游关系和分工。它们主要负责将泛素化的蛋白送往液泡中降解，同时，还参与细胞自噬和病毒出茅等。在ESCRT的突变体中，晚期内体无法形成MVB，并会在液泡附近形成E型结构(Class E compartment)。
目前，关于ESCRT与细胞自噬的关系的研究得到了广泛的重视。近年来有研究表明在饥饿诱导形成自噬体过程中，ESCRT通路的表达量会上调。但也有文献表示ESCRT突变体中自噬受阻可能是由于MVB形成受阻间接引起的。本文通过基因敲除、蛋白互作、荧光定位、免疫印迹等技术，重点探讨了酿酒酵母中ESCRT复合体部分亚基缺失后对非选择性自噬和脂滴自噬的影响。得到如下主要结果:
1.ESCRT-Ⅰ复合体各亚基缺失突变体中细胞自噬受阻
GFP-Atg8降解和prApe1的成熟情况可用于反映酵母中细胞自噬的水平。在饥饿诱导的细胞自噬中，ESCRT-Ⅰ复合体各亚基缺失后，GFP-Atg8不同程度呈块状堆积，不能正常进入液泡中降解，其中Vps23缺失突变体中堆积表型最为明显:整个ESCRT-Ⅰ复合体缺失的四敲突变体中自噬缺陷显著增强。
2.Vps23与Vps38、Vps15、Vps34及自噬相关蛋白Atg17、Atg20、Atg24存在互作
酵母双杂交检测到Vps23与PI3K复合体中Vps38、Vps15、Vps34存在互作，其中与Vps15的互作最强。此外，Vps23与自噬相关蛋白Atg17、Atg20、Atg24也存在较强互作。利用双分子荧光互补技术(BiFC)进一步验证了Vps23与Atg17、Atg20、Atg24之间的互作，且互作发生在在内体和自噬体组装位点(PAS)上。为了探讨这些互作与细胞自噬的关系，我们构建了双缺突变体vps23△atg17△、vps23△atg20△、vps23△atg24△，荧光观察及Westernblot定量检测GFP-Atg8的降解比例及Ape1的成熟比例，结果显示vps23△atg17△、vps23△atg20△、vps23△atg24△中自噬受阻程度显著增强。
3.互作蛋白之间的遗传互作及对彼此定位的影响
vps23△atg17△菌株中GFP-Atg8呈点状聚集在PAS上，与atg17△单敲突变体中类似，说明自噬被阻断在早期阶段:Vps23缺失对Atg17在PAS的定位没有影响，Atg17缺失会造成Vps23相对弥散。在自噬开始时，Atg17作为支架蛋白首先聚集在PAS位点，并招募其它Atg蛋白。因此我们推测，在自噬过程中Atg17很有可能直接招募Vps23进而招募其它ESCRT蛋白。
vps23△atg20△、vps23△atg24△双缺突变体中GFP-Atg8呈月牙状堆积在液泡边，与vps23△单敲菌株中类似，说明自噬体能够大量形成，自噬被阻断在后期阶段:Vps23缺失会造成Atg20、Atg24呈块状堆积在ClassE结构中，不能正常定位。反之Atg20、Atg24缺失对Vps23的定位无明显影响。Atg20和Atg24被报道参与选择性自噬Cvt途径，其中机理尚不明确。但Atg20和Atg24的缺失确实会增强vps23△菌株中的自噬缺陷，这一结果提示我们，Atg20和Atg24可能在非选择性自噬中同样发挥一定的作用。
4.ESCRT核心亚基Snf7，Vps4缺失促进脂滴自噬
脂滴中的甘油三酯(Triglycerides，TAG)可以通过自噬途径与溶酶体融合并被溶酶体内的脂肪酶水解成脂肪酸被线粒体利用，这种自噬途径被称为脂滴自噬(Lipophagy)。Atg15是酿酒酵母中的一种磷脂酶，定位于液泡内。它可以降解液泡中的自噬小体及Cvt小体。最近有文献报道Atg15同样参与脂滴自噬，其功能是降解脂滴的主要成分之一甘油三酯(TAG)，对维持胞内脂滴的循环起重要作用。
实验室前期数据表明，在ESCRT突变体中，Atg15的运输受阻，几乎全部堆积在ClassE中。因此我们很迫切地探讨ESCRT与脂滴自噬之间的关系。初步结果如下:Westernblot定量分析脂滴自噬标记蛋白Erg6的降解情况，野生型中Erg6-GFP的降解比例大约为16％，atg15△菌株的几乎不降解:而snf7△、vps4△菌株中Erg6-GFP降解比例分别高达39％、46％:双敲突变体atg15△snf7△、atg15△vps4△中Erg6-GFP同样不降解，与atg15△菌株类似。荧光观察发现snf7△、vps4△突变体中脂滴进入液泡的活细胞比例分别达到了22％、27％，远远高于野生型中的2％，这一结果与Westernblot结果比较类似。这些结果说明:ESCRT核心亚基Snf7，Vps4缺失会促进脂滴自噬。
Tg13和Tg14是酿酒酵母中的脂肪酶，可以将脂滴中的甘油三酯(TAG)降解为甘油二酯(DAG)，定位于脂滴上。snf7△、vps4△菌株中，Tg13、Tg14与脂滴的共定位比例无明显变化，Westernblot结果显示snf7△、vps4△菌株中Tg13、Tg14的蛋白水平比WT中明显降低。脂滴在细胞中运输时，与部分细胞器会有互相接触，比如线粒体，内涵体等，有人猜测这种接触可能为细胞器之间进行脂质交换提供便利。在诱导脂清自噬条件下，野生型中脂滴与晚期内涵体的共定位比例高达68％，而vps4△突变体中共定位比例仅有26％。这说明，ESCRT突变体中脂滴不能正常与晚期内涵体正常接触。
以上结果初步表明ESCRT复合体参与了非选择性自噬和脂滴自噬，这些结果为阐释ESCRT系统在非选择性自噬和脂滴自噬中的调控机制提供了重要的理论与实验依据。