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目的：用无免疫原性的非病毒载体阳离子聚酰胺-胺型树枝状聚合物(PAMAM-D)纳米颗粒做为载体，介导双自杀基因TK及CD，转染人Tenon’囊成纤维细胞(HTFs)，观察其在体外对HTFs的杀伤情况及未转染细胞的“旁观者效应”，进而寻找一种安全、有效抑制青光眼滤过手术后滤过通道瘢痕化的治疗方法。
方法：
1.采用PCR、酶切、连接等技术融合自杀基因yCD和HSV-TK构建含双自杀基因的基因表达质粒pAcGFP1-Hyg-TK-CD，并用酶切及测序的方法证实其正确性；
2.利用增强型绿色荧光蛋白真核表达质粒pEGFP-C1作为报告基因，选择第二、第五代PAMAM-D作为基因转移载体，并以脂质体LipofectamineTM2000为对照转染HTFs细胞，应用透射电镜、动态激光散射和电位分析仪等测定各载体表征；抗核酸酶试验检测载体对基因的保护能力；通过改变质粒DNA的浓度、转染复合物质量比等条件参数，优化PAMAM-D转染方案；
3.体外培养HTFs，经细胞形态学、组织学及免疫细胞化学鉴定；以PAMAM-D纳米颗粒为载体，将载有双自杀基因的质粒pAcGFP1-Hyg-TK-CD转染HTFs，分别用RT-PCR、Westen-blot等方法检测鉴定双自杀基因TK、CD在HTFs内的表达；
4.MTT法检测5-FC、GCV对HTFs的毒性及自杀基因前药系统对表达自杀基因的HTFs-TK-CD细胞的杀伤效应；选择前药5-FC、GCV最佳的作用药物浓度，使其细胞毒性最小，对细胞的杀伤作用最强；光镜及透射电镜观察前体药物GCV及5-FC作用后HTFs的形态变化，流式细胞仪检测HTFs的凋亡率，并观察双自杀基因的“旁观者效应”。
结果：
1.实验构建的质粒酶切产物琼脂糖凝胶电泳所得片段大小为1617bp，与预期片段一致；测序证实最终质粒与pAcGFP1-Hyg-TK-CD序列一致。
2.PAMAM-D纳米颗粒在pH5-10具有高的缓冲能力，PAMAM-D/DNA转染复合物的平均粒径小于100 nm；且PAMAM-D可以在保持质粒DNA完整性的同时增加其对核酸酶的抵抗力；转染质量比对载体的转染效率影响最明显，G2-PAMAM、G5-PAMAM、Lipid与DNA的最佳转染质量比分别为8:1、2:1、4:1，在最佳质量比条件下转染细胞，G5-PAMAM的转染效率明显高于G2-PAMAM(42.1％vs19.4％，P<0.05)。
3.成功培养出：HTFs细胞，转染双自杀基因的HTFs-TK-CD细胞分别经RT-PCR及Westen-blot检测鉴定，证明分别有双自杀基因TK及CD mRNA及蛋白质在HTFs内的表达；
4.采用GCV3μg/ml、5-FC200μg/ml是本实验选择的最佳前体药物浓度。光镜下未转染自杀基因的HTFs细胞，应用前体药物GCV和/或5-FC后，细胞生长状态和增殖无明显变化；且GCV和5-FC联合用药较二者单独用药无明显差异；转染自杀基因的HTFs细胞，应用前体药物后，与对照组相比细胞生长状态变差，细胞数量减少；且GCV和5-FC联合应用较二者单独应用细胞生长状态和数量变化更明显。透射电镜下表现细胞的凋亡变化。HTFs-TK-CD组加入前体药物GCV3μg/ml、5-FC200μg/ml及后，细胞凋亡率分别为11.86％和22.37％，二者联合应用时，凋亡率为33.13％。GCV与5-FC不仅能杀伤转染的HTFs细胞，而且具有“旁观者效应”。
结论：
1.利用基因工程技术，使用CD和TK成功构建了含双自杀基因的基因表达载体pAcGFP1-Hyg-TK-CD，经检测及测序证实其正确性；
2.PAMAM-D纳米载体安全低毒，在较大的pH范围内和不同缓冲液条件下能稳定存在且具有DNA保护功能，其转染效率主要取决于PAMAM-D与DNA复合物的质量比，同时受质粒DNA浓度、PAMAM-D代数等因素的影响；
3.G5-PAMAM-D纳米颗粒介导HSV-TK/GCV联合CD/5-FC双自杀基因系统成功转染HTFs，并通过RT-PCR及Western blot检测证实得到表达；
4.双自杀基因TK、CD转染HTFs细胞后，给予前药5-FC、GCV达到一定浓度时，它们转化而成的细胞毒性物质对HTFs细胞在体外产生杀伤作用，采用GCV3μg/ml、5-FC200μg/ml是本实验选择的最佳前体药物浓度。且联合应用5-FC+GCV对HTFs细胞在体外产生的杀伤作用强于二者单独应用，并存在“旁观者效应”，为最终提高青光眼手术成功率奠定基础。