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目的:本研究运用网络药理学和转录组学测序技术,筛选内异膏治疗子宫内膜异位症的差异表达基因,探究潜在的靶点和信号通路,揭示其作用的分子机制,并结合实验验证以期从现代生物学角度解析内异膏的干预机制,以期为内异膏的临床研究提供更多的实验数据。方法:1.采用自体移植手术方法,制备SD大鼠子宫内膜异位症模型,将其分为假手术组、模型组、西药组、内异膏低、中、高组共6组,28天后进行药物灌胃,假手术组和模型组予相同体积的生理盐水,中药组灌胃内异膏低中高剂量,西药组灌胃地诺孕素混悬液,连续灌胃28天,取大鼠子宫及移植物组织,并对大鼠的体重及移植物病灶体积进行测量和病理组织学观察（HE染色）从而探讨内异膏对子宫内膜异位症的治疗作用。2.利用转录组RNA测序技术（RNA sequencing,RNA-seq）测序分析假手术组、模型组、中药组每组3只大鼠的子宫组织及异位病灶,对其总RNA进行提取和检测,进行文库构建,进行转录组测序,筛选出三组差异基因,并对三组差异基因进行GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析。3.在TCMSP等数据库收集并筛选内异膏的主要活性成分及其靶点,通过OMIM等数据库收集子宫内膜异位症疾病靶点;利用venn图获得药物成分靶点与疾病之间的交集靶点;利用基因富集分析在线工具（Metascape）对药物成分与疾病的交集靶点进行基因进行基因本体（Gene ontology,GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路富集分析。4.按照纳排标准,收集佛山复星禅诚医院住院的子宫内膜异位症巧囊患者,对其异位内膜进行分离培养原代子宫内膜间质细胞,采用免疫荧光法鉴定此细胞。制备内异膏含药血清和空白血清,将两者分别干预子宫内膜间质细胞,CCK8法来筛选最佳药物干预浓度,将细胞按照最佳药物干预浓度分组,结合网药及转录组学结果进行PCR验证。5.制备动物模型及药物干预同上,取大鼠子宫及移植物病灶组织,通过免疫印迹实验及荧光定量PCR、免疫荧光实验对转录组学结果及网络药理学结果进行验证。结果:1.内异膏治疗子宫内膜异位症大鼠的作用:（1）本次实验共70只大鼠造模,1只大鼠术中未清醒,术后28天后再次剖腹探查发现16只未成模,余53只大鼠均见典型的球形或半球形异位囊肿,与周围组织、浅表或可见血管粘连,包含透明半透明液体或蓝紫色结节。连续给药4周后再次剖腹取材,总造模成功率为76.8%（53/69）。（2）对各组大鼠进行剖腹探查发现,模型组移植物生长良好,体积大,病灶周围组织可见明显粘连,表面可见明显血管,经内异膏及地诺孕素处理后可见病灶体积明显缩小。低剂量内异膏组可见异位病灶体积缩小,与周围组织粘连;中剂量内异膏组次之;高剂量内异膏组可见移植物明显缩小,偶见周围组织粘连。大鼠异位病灶病理显示:假手术组子宫内膜完整,柱状上皮排列整齐、完整,间质细胞可见腺体;模型组大鼠异位内膜可见上皮细胞多呈柱状或高柱状,间质细胞减少,可见少量炎性细胞浸润;内异膏低、中组及地诺孕素组大鼠异位病灶上皮变薄,间质细胞减少;内异膏高剂量组可见上皮扁平,间质细胞中炎性细胞明显减少。(3大鼠连续4周体重增长情况:给药前各组大鼠的体重增长无明显差异（P＞0.05）;各组在给药后大鼠体重呈现不同程度增长趋势,假手术组呈稳定增长趋势,模型组增长缓慢,内异膏低、中、高组大鼠体重呈逐渐增长趋势,与模型组相比,各组大鼠体重增长无显著差异（P＞0.05）（4）与模型组相比,用药28天后内异膏低、中、高剂量组大鼠异位病灶体积显著缩小（P＜0.05）;地诺孕素组异位病灶体积无显著差异（P＞0.05）2.转录组测序分析:（1）以模型组为基准,采用两组两两比较形式,由此得出差异表达基因（DEGs）,其中假手术组VS模型组共筛选出189个差异基因,其中上调基因131个,下调基因58个;模型组VS内异膏高剂量组共筛选出255个差异基因,其中上调基因68个,下调基因187个;假手术组VS内异膏高剂量组共筛选出740个差异基因,其中上调基因390个,下调基因350个。合并两个比较组分析显示:假手术组-模型组与模型组-内异膏高剂量组共有26个交集差异基因。（2）在内异膏高剂量组VS模型组的GO富集中,显著差异表达基因主要富集在细胞过程、生物调控过程、代谢过程、细胞增殖等生物过程中。主要涉及细胞器、蛋白质复合体和胞外区。在分子功能上,与转录调节活性、分子功能调节剂、催化活性等有关。在假手术组VS模型组的GO富集中,显著性差异表达基因在生物过程中主要富集到表明其在生物过程方面主要与细胞过程、生物调节、多细胞生物过程等有关;在细胞组成方面与主要参与细胞器部分、细胞外区域部分、突触等有关;在分子功能方面主要参与结构分子活性、抗氧化性等。（3）假手术组VS模型组KEGG富集通路主要包括1L-17信号通路、PI3K-AKT信号通路、JAK-STAT信号通路、TNF信号通路等;模型组VS内异膏高剂量组KEGG富集通路主要包括P53信号通路、FOXO信号通路、细胞周期等。3.网络药理学分析:得到内异膏活性成分341种,主要活性成分有:槲皮素、β-谷固醇、山奈酚、常春藤皂苷元、豆甾醇、异鼠李素、芍药苷等。药物靶点与疾病靶点交集为278个,内异膏PPI网络分析其主要靶点主要包括:TP53、AKT、MAPK14、MAPK1、SRC、ESR、PIK3CA、IL-6等,调控P53信号通路、PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路等。4.体外实验验证转录组学及网药结果:成功培养并鉴定原代子宫内膜间质细胞,与对照组相比,5%含药血清组BAX及Caspase3m RNA表达无统计学意义（P＞0.05）,7.5%含药血清组、10%含药血清组BAX及Caspase3m RNA表达上调（P＜0.05）,7.5%含药血清组、10%含药血清组BCL-2m RNA表达下调（P＜0.05）。5.体内实验验证转录组学及网药结果:将网络药理学富集到的前20条通路与转录组学富集到的前20条通路取交集,得到1条共有通路:P53信号通路。选取此通路上的关键蛋白进行初步验证:q PCR及western blot显示内异膏可以上调内异症大鼠BAX及Caspase3表达（P＜0.05）,下调BCL-2表达（P＜0.05）。免疫荧光检测Ki67结果提示模型组大鼠异位子宫内膜组织Ki67增殖指数显著增高,内异膏高剂量组和地诺孕素组Ki67增殖指数显著降低。结论:1.内异膏可以有效缩小内异症大鼠异位病灶体积和改善异位病灶组织形态,具有明显的治疗子宫内膜异位病灶的作用。2.内异膏可能是通过多成分、多靶点、多种信号通路、多种生物学过程共同发挥抗子宫内膜异位症的作用,其中P53信号通路可能是内异膏治疗子宫内膜异位症的重要信号通路。