鸭瘟病毒GD01株部分基因的克隆及TK基因缺失转移载体的构建

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鸭瘟(Duck Plague,DP),又名鸭病毒性肠炎(Duck Viral Enteritis,DVE),是由鸭病毒性肠炎病毒(Duck Enteritis Virus,DEV)引起的鸭、鹅及多种雁形目禽类的一种急性败血性传染病,其临床特征为体温升高、两腿麻痹、下痢、流泪和部分病鸭头颈肿大。DEV属于疱疹病毒科,但尚未确定其所属的亚科。近年来,大量的DEV基因组序列已经提交到GenBank,但是对其基因组结构和功能的研究才刚刚起步。gH、gB、TK、UL24、PK和dUTPase基因编码的蛋白可能与病毒的复制、增殖以及病毒感染有关。 本研究采集了广东惠州博罗县某番鸭场的病料,经过PCR鉴定以及人工感染雏鸭,成功获得一株鸭瘟病毒,命名为GD01株。根据已发表的鸭瘟病毒gH(UL22)、TK(UL23)、UL24、gB(UL27)、dUTPase(UL50)、PK(US3)基因序列,设计合成了引物,对DEV GD01株的六个基因进行了PCR扩增,产物克隆至PTA2载体并进行测序。结果显示:gH基因ORF全长为2505 bp,编码834个氨基酸;TK基因ORF全长为1077 bp,编码358个氨基酸;UL24基因ORF全长为1230 bp,编码409个氨基酸;gB基因ORF全长为3003 bp,编码1000个氨基酸;dUTPase基因ORF长为1344 bp,编码447个氨基酸;PK基因ORF全长为1158 bp,编码385个氨基酸。与在GenBank上其他DEV毒株的同源基因进行比较,发现这些基因在DEV基因组中都高度保守。gH基因核苷酸的一致性为99.8%~99.9%,氨基酸一致性为99.6%~99.9%;TK基因核苷酸的一致性为99.5%~100%,氨基酸一致性为98.9%~100%;UL24基因核苷酸的一致性为99.8%~99.9%,氨基酸一致性为99.8%~100%;gB基因核苷酸的一致性为99.8%,氨基酸一致性为99.4%~99.5%;dUTPase基因核苷酸的一致性为99.9%,氨基酸一致性为99.8%;PK基因核苷酸的一致性为99.8%~100%,氨基酸一致性为99.7%~100%。根据这六个基因的系统发育进化树分析推测,DEV GD01株与GenBank上其他DEV毒株的亲缘关系都较近。 将鸭瘟病毒疫苗株UL22-TK—UL24 DNA片段克隆于pBluescript SK+载体中,构建了pBlueSK-TK质粒。将PCR扩增的EGFP真核表达盒插入pBlueSK-TK质粒的TK基因内部476位的BsiWⅠ和577位NruⅠ之间,缺失了其中间部位约102个碱基,左同源臂为943 bp,右同源臂为1325 bp,获得转移载体pBlueSK-TK—EGFP。pBlueSK-TK—EGFP质粒在脂质体介导下,转染BHK—21细胞和鸭胚成纤维细胞,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白,表明绿色荧光蛋白得到了有效的表达。鸭瘟病毒TK基因转移质粒的成功构建,为进一步开展重组鸭瘟病毒和嵌合病毒的研究以及构建具有遗传标记的鸭瘟疫苗奠定了基础。
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