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泛素化是一种在细胞中普遍存在的、分布广泛的蛋白质翻译后修饰过程。在所有人类细胞中都发现存在泛素化的过程。在蛋白上添加或者移除泛素会引起不同的细胞反应，导致细胞存活、增殖或者死亡。因此，泛素化对于维持细胞的动态平衡非常重要。相应的，泛素化过程的功能故障会产生很多疾病，如阿尔茨海默症、帕金森氏综合症和癌症等。因此，研究泛素化系统非常重要。 泛素(UB)是包含76个氨基酸的小蛋白。泛素能共价结合到靶标蛋白进行翻译后修饰，这个过程叫做泛素化。靶标蛋白结合或者移除泛素会产生有不同的后果，例如它可以打开或者关闭信号通路。病毒中也有类似的过程，并且已经进化出能编码一种蛋白酶。例如，冠状病毒的木瓜蛋白酶样的蛋白酶(PLpro)能降解多聚泛素链来阻止激活抗病毒信号通路。体内存在泛素的单体或者多聚形式，它们在体内执行不同的功能。一个错综复杂的泛素化系统包括3个酶:E1、E2和E3。这三种酶有不同的特异性，能在靶标蛋白上组装不同类型的多聚泛素链。现在还不清楚不同连接的多聚泛素链是怎么组装形成的。因为不同连接的多聚泛素链可以执行不同的功能，而这些功能的失控会产生致命性疾病。所以开展这方面的研究非常重要。现在泛素化的很多方面还未知，本论文研究了泛素化的3个方面:1，K-48连接的多聚泛素链是怎么组装的？2，多聚泛素链是怎么去组装的？3，多聚泛素链降解的意义是什么？ 已知有两种人的E2酶:Ube2Z和Ube2H能作为模型来研究多聚泛素链组装过程中特异性是怎么获得的。我们利用不依赖连接的方法(LIC)来构建Ube2Z和Ube2H克隆。通过亲和层析、离子交换和分子筛层析等一系列的纯化方法得到均一的蛋白。通过类似的方法表达纯化激活酶UBA1和UBA6。在酶活实验中利用这些酶证实了Ube2H和Ube2Z能正确折叠。激活酶能把泛素共价结合到Ube2H和Ube2Z蛋白。我们在分子水平上研究了UB和这两种酶通过非共价相互作用来引起多聚泛素链合成的详细信息。UB在Ube2H存在的条件下结晶。晶体的X射线衍射达到1.5(A)。可是晶体的晶胞较小，表明只有泛素结晶。令人吃惊的是，我们观察到泛素分子以非共价连接的K-11和K-48连接多聚泛素链方式排列。Ube2H通过分子印记来定向UB和促进连接特异性链的延伸。在论文的第二部分我们从人脑的cDNA中克隆得到的Uch37-Rpn13复合物，并且利用该复合物来研究多聚泛素链的降解。Uch37的生物物理和功能研究揭示了在降解K-48连接多聚泛素底物过程中Rpn13激活Uch37的机制。Uch37在溶液中是寡聚和自我抑制的。移除C端延伸区域使Uch37由寡聚化转换成单体形式。这些单体Uch37比全长的寡聚形式的Uch37活性更强。Uch37和Rpn13C的复合物表现出较低的分子量，表明Rpn13能使Uch37去寡聚化。随后利用SEC、AUC和SAXS方法测定分子量，表明Uch37和Rpn13形成1∶1的复合物。因此，Rpn13能使Uch37单体化从而激活Uch37。酶活实验和FRET分析支持这种Rpn13激活Uch37的机制。通过建模和低分辨率下拟合模型使Uch37和Rpn13C复合物形象化。在该模型中，一分子的Uch37与一分子的Rpn13C相互作用。这种模型解释了Uch37单独自我抑制而Rpn13C通过单体化激活Uch37的机制。单体化使Uch37的活性位点容易接近泛素来完成去泛素化。最后，我们通过鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的木瓜蛋白酶样的蛋白酶(papain-like protease，PLpro)研究了多聚泛素链的重要性。IBV PLpro2.15(A)分辨率的结构与SARS CoVPLpro的结构类似。不同的是，SARS CoV PLpro缺少BL1，而IBV PLpro有一个短的BL1样的loop。一个柔性的BL2 loop调节底物进入保守的催化三联体(Cys101、His264、Asp275)。IBV PLpro结合UB的模型揭示了不同PLpros底物结合位点的关键不同。晶体结构和功能实验的结果表明，这种病毒的酶能降解K-48和K-63连接的多聚泛素链，从而能阻止宿主的抗病毒反应。 本研究不止能帮助我们了解泛素化系统，也为靶标泛素化系统的治疗干预打开了新的通路。例如，IBV PLpro的结构可以用来设计小分子抑制剂，从而阻止病毒降解多聚泛素链和逃避宿主的抗病毒信号通路。这类小分子抑制剂可以发展成抗病毒药物。