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Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）因其胞外段与果蝇的Toll蛋白同源而得名,属于Ⅰ型跨膜受体,由胞外区、跨膜段和胞内区3部分组成,广泛分布于不同物种与组织,参与机体免疫防御反应。目前已成功克隆出11种人的TLRs和13种小鼠的TLRs。作为模式识别受体家族成员,TLR主要识别病原微生物的“共性”成分一病原相关分子模式（pathogen associated molecule pattern,PAMP）,TLRs特异性结合自身配体后,通过髓样分化因子88（Myeloid differentiation factor,MyD88）依赖性或非依赖性途径激活下游一系列蛋白级联反应,将刺激信号转导至细胞核内,导致核因子-κB（Nuclear factor-kappa B,NF-κB）、活化蛋白-1、干扰素调节因子等重要免疫基因转录因子的活化,诱导相应细胞因子如白细胞介素（Interleukin,1L）-1、-2、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）及干扰素的合成与释放,并通过促进树突状细胞的成熟而启动获得性免疫反应,最终激发一系列针对不同病原微生物的免疫事件。研究认为,机体多种免疫防御反应均需要不同TLRs的参与。TLRs不仅构成机体抗感染免疫的“第一道防线”,在启动早期天然免疫应答中起重要作用,更成为联系天然免疫和获得性免疫的“桥梁”,对获得性免疫的发生和发生类型具有重要的调控作用。方剂,是在治法指导之下,针对所主治病证的病机,根据药物的性质、功效及其配伍关系,按照一定组方原则,将多味药物组合在一起运用的形式。“方证相应”是指一首方剂内的药味及其配伍关系与其针对的病证病机之间具有高度的对应性。证的病机决定了方药的选择,而方中的药物配伍关系总是对应于病证的病机,“方证相应”强调了方药与病证之间的内在关系,即方剂的功用是特定方药与特定病证之间相互作用的结果,方药-机体的密切关联是中医辨证论治中的重要特征。“方证相应”研究是深入揭示方剂功能主治和证的现代科学内涵的重要内容。主治不同证候的多个代表方剂的功能比较研究,以中医外感热病某些表证及其相应代表方剂作为“方证相应”研究的切入口,不失为探讨“方证相应”实验研究的一种可用手段。凡以解表药为主要组分,具有宣散表邪、发汗解肌、透疹消疮等作用,可以解除表证的一类方剂,统称解表剂。主要治疗六淫之邪侵入肌表,引起的各种表证,以及麻疹初期,疮疡初起,兼有发热、恶寒、头痛、身疼、脉浮等表证者。根据外感疾病的寒温性质不同,解表剂可分为辛温解表剂和辛凉解表剂。现代研究认为解表剂可治疗病毒感染性疾病。本实验选择临床应用广泛、疗效确切的辛温解表剂桂枝汤、麻黄汤,辛凉解表剂银翘散、桑菊饮作为受试药物,制备含药血清,以与天然免疫密切相关的肺巨噬细胞RAW264.7作为研究对象,在mRNA水平分析研究四个组方对桂枝汤证病人血清所致RAW264.7细胞表达Toll样受体各亚型（1～9）及其介导产生的炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-β改变的影响。现将实验结果简述如下:一、健康人、桂枝汤证病人血清对RAW264.7细胞活性的影响分别以终浓度为7.5%,5.0%,2.5%,1.25%,0.625%的健康人或者桂枝汤证病人血清作用于RAW264.7细胞,MTT法检测对细胞活性的影响。结果发现,在实验浓度（0.625～7.5%）下健康人血清未出现细胞毒性。桂枝汤证病人血清在浓度5%时即开始出现明显的细胞毒性。确定了在以后实验中桂枝汤证病人血清的加入浓度应该控制在2.5%以内。二、健康人、桂枝汤证病人血清对RAW264.7细胞Toll样受体（1-9）mRNA表达的影响分别以终浓度为10%,6%,3.5%,2%,1.3%的健康人或者桂枝汤证病人血清刺激RAW264.7细胞,分析其对RAW264.7细胞Toll样受体（1-9）mRNA表达的影响。结果表明,健康人血清不同浓度组对TLRs 9种亚型mRNA表达未见显著影响（p＞0.05）;桂枝汤证病人血清可显著提高TLR-3、TLR-4、TLR-9 mRNA的表达（p＜0.01）,且在2%时达到作用峰值,TLR-3mRNA表达量为刺激前的1.72倍,TLR-4、TLR-9mRNA的表达均达到刺激前的1.77倍。对TLR-1、TLR-2、TLR-5、TLR-6、TLR-7和TLR-8的mRNA表达未见显著影响。本实验结果提示,TLR-3、TLR-4、TLR-9mRNA的表达上调,可能是中医桂枝汤证在免疫调节环节上的现代病理基础之一。三、健康人、桂枝汤证病人血清对RAW264.7细胞分泌炎性因子的影响分别以终浓度为10%,6%,3.5%,2%,1.3%的健康人或者桂枝汤证病人血清刺激RAW264.7细胞,ELISA法测定细胞培养上清液中细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-β的含量。结果发现,健康人血清不同浓度组对所测IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-β均无明显影响（p＞0.05）;桂枝汤证病人血清各浓度组对所测IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-β的分泌均有明显促进作用（p＜0.05或p＜0.01）,除IFN-β外,IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌均在桂枝汤证病人血清浓度为2%时达到峰值。上述实验结果提示,桂枝汤证病人血清刺激RAW264.7巨噬细胞后产生的免疫相关的细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-β）分泌,可能是中医桂枝汤证在免疫调节环节上的又一重要的现代病理基础。四、解表四方含药血清对桂枝汤证病人血清所致RAW264.7细胞Toll样受体（1～9）mRNA表达改变的影响本实验首先制备大鼠含桂枝汤、麻黄汤银翘散、桑菊饮等四个方剂的含药血清,研究其对RAW264.7细胞活性的影响。细胞在给予桂枝汤证病人血清2%的同时,加入各剂量的含药血清（桂枝汤:3.3、2.0、1.2、0.7和0.4g/kg/U;麻黄汤:2.4、1.4、0.8、0.5和0.3g/kg/U;银翘散6.3、3.8、2.2、1.3和0.8g/kg/U;桑菊饮:3.9、2.3、1.3、0.8和0.5g/kg/U）,作用24h后以MTT法检测细胞存活情况,结果表明桂枝汤等四个组方对细胞活性有促进作用（p＜0.05或p＜0.01）,在试验剂量下无细胞损伤作用。在此基础上,以桂枝汤证病人血清（2%）刺激RAW264.7细胞,分别以桂枝汤、麻黄汤、银翘散和桑菊饮的含药血清进行干预,分析Toll样受体（1～9）mRNA表达的情况。结果表明,桂枝汤含药血清除其最小浓度对TLR-4、TLR-9 mRNA的表达无显著影响外,其它各浓度对TLR-3、TLR-4、TLR-9 mRNA的表达均有显著的抑制作用（p＜0.05或p＜0.01）,且呈现一定的量效关系。麻黄汤含药血清除其最小浓度外,其它各浓度对桂枝汤证病人血清所致的TLR-3、TLR-4 mRNA表达的上调具有明显的抑制作用（p＜0.05或p＜0.01）,并呈现一定的量效关系;银翘散和桑菊饮的含药血清除其最小浓度外,对桂枝汤证病人血清所致的TLR-4 mRNA的表达有明显的抑制作用（p＜0.05或p＜0.01）,呈现一定的量效关系。根据四方含药血清不同浓度（剂量）对TLR-3、TLR-4、TLR-9mRNA表达的抑制率,用Logit法计算各方含药血清的IC50。数据显示,桂枝汤含药血清对TLR-3的IC50（以含药血清在培养液中的浓度计为2.7%;以含药血药在培养液中所含的药物剂量计为0.9g/kg/U,下同）最小,对TLR-4、TLR-9的IC50较为接近,分别为5.1%（1.7g/kg/U）和4.1%（1.4g/kg/U）;麻黄汤含药血清对TLR-3和TLR-4的IC50值接近,分别为8.0%（1.9g/kg/U）和7.1%（1.7g/kg/U）,对TLR-9的IC50值只能通过外推法计算;银翘散或桑菊饮的含药血清对TLR-4的IC50值分别为5.4%（3.4g/kg/U）和6.9%（2.6g/kg/U）,对TLR-3和TLR-9的IC50值均只能通过外推法计算。五、解表四方含药血清对桂枝汤证病人血清所致RAW264.7细胞分泌炎性因子改变的影响为考察含药血清对TLRs介导产生细胞因子的影响,以桂枝汤证病人血清（2%）刺激RAW264.7细胞,分别以桂枝汤、麻黄汤、银翘散和桑菊饮含药血清进行干预,24h后用ELISA法测定细胞培养上清液中细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-β的含量,用Logit法计算相应的IC50。结果显示,桂枝汤含药血清对四种细胞因子分泌的IC50较为接近,与其他三个方相比,其IC50值最小;麻黄汤含药血清对IL-1β和IFN-β分泌的IC50接近,分别为8.2%（1.9g/kg/U）和7.4%（1.7g/kg/U）,对IL-6和TNF-α的值只能用外推法计算;银翘散含药血清对IL-1β和IL-6分泌的值只能用外推法计算,由于对TNF-α、IFN-β的作用无浓度依赖关系,故无法计算;桑菊饮含药血清对IL-1β的值为4.3%（1.7g/kg/U）,对IL-6和IFN-β的值只能用外推法计算,而对TNF-α分泌的作用作用无浓度依赖关系,故无法计算。综上所述,健康成人的血清对巨噬细胞RAW264.7的TLR-1～TLR-9的mRNA表达无明显影响,对它们介导的细胞因子的分泌也无明显影响。未治疗的上呼吸道感染具有桂枝汤证的患者血清能激惹引起TLR-3、TLR-4、TLR-9mRNA的表达和IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-β的分泌升高。桂枝汤含药血清对桂枝汤证病人血清所引起各TLRmRNA的高表达及其介导的诸细胞因子高分泌,均有显著下调作用。与桂枝汤含药血清等浓度,同为辛温解表的麻黄汤含药血清仅能抑制TLR-3、TLR-4的高表达和IL-1β、IL-6的高分泌,辛凉解表的的银翘散、桑菊饮含药血清仅能抑制TLR-4的高表达和IL-1β、IL-6的高分泌。本实验的结果从一个侧面折射出中医学的辨证论治、方证相应理论的科学性和合理性,并为此提供了分子水平的实验依据。