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肺癌目前已经成为发达国家的主要死亡原因,发展中国家的次要死亡原因。对于肺癌的治疗,目前主要的治疗手段包括传统的放射治疗、手术切除肿瘤、药物治疗以及新兴的肿瘤生物治疗。由于手术,放化疗在治疗中会给患者带来巨大的毒副作用,因此生物治疗凭借其显著疗效的优势成为第四种重要的肿瘤治疗模式。肿瘤生物治疗主要包括:过继细胞治疗、细胞因子治疗、肿瘤疫苗、靶向分子治疗等。目前关于过继细胞治疗的研究比较多,其中就包括了肿瘤浸润淋巴细胞(TIL),而在这些TIL中CD8+T细胞是最主要的效应细胞。1986年Rosenberg研究组首先报道了肿瘤浸润淋巴细胞。并将分离出来的TIL体外扩增然后回输体内,用于治疗转移的黑色素瘤,效果比较好。TIL是一种非常有效的抗肿瘤的效应细胞。在体外,它们特异性的杀伤肿瘤细胞,并且,在少量的IL-2存在的条件下,TIL就可以维持其体内高效的抗肿瘤效应,所以在肿瘤过继免疫治疗中,他们是继淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)细胞后的又一高效抗瘤效应细胞。近几年来TIL过继免疫治疗在动物肿瘤模型以及临床应用研究中取得了很好的疗效,因而在肿瘤过继免疫治疗中的作用受到重视。虽然有着许多优点,但是TIL的肿瘤免疫治疗仍存在许多不足。 CD8+T细胞能特异性杀伤靶细胞,因而在抗肿瘤过程中发挥着关键作用,同时也是过继细胞治疗的重要组成成分。在急性感染中,CD8+T细胞接受抗原刺激后,活化并大量增殖,分化成效应性CD8+T细胞,杀伤靶细胞,当病原菌清除后,一小部分效应性CD8+T细胞分化成记忆性CD8+T细胞,当相同抗原再次出现时,机体里的记忆性CD8+T细胞会迅速增殖、分化,进而清除感染。而在慢性感染和肿瘤中,抗原特异性的CD8+T细胞由于受到抗原持久的刺激,不能有效分化成记忆性T细胞而逐步演变成功能紊乱的一群细胞。称之为衰竭性CD8+T细胞。这群细胞表面持续性高表达PD-1抑制性受体,除了PD1以外,抗原特异性的CD8+T细胞表面还共表达CD244(2B4),LAG-3,CD160,TIM-3,CTLA-4和以及其他抑制性受体。PD1已被公认为是衰竭性T淋巴细胞的表面标志。研究发现在慢性感染性疾病中,阻断PD1和 CTLA-4、PD1和LAG-3、PD1和Tim-3可以部分恢复CD8+T细胞的生物学功能,此外,研究发现对于肿瘤抗原特异性的CD8+T细胞,阻断PD1和Tim-3,或者PD-1和LAG-3,可以部分恢复CD8+T细胞功能。尽管阻断这些通路后可以部分恢复衰竭性T细胞的功能,但还是不能使这些衰竭性T细胞逆转成非衰竭性T细胞,从而导致肿瘤复发、转移等,不能达到根治的目的。 近几年对于微小RNA(miR)研究比较多,miR是一类内源性的长度约21-23个核苷酸的非编码RNA,在转录后和翻译水平上影响基因表达。miR通过碱基互补配对结合到信使RNA的3UTR(3’端非编码区)上,通过转录抑制和(或)降解mRNA,从而下调目的蛋白的表达。目前许多研究表明微小RNA调控着细胞生物学进程的关键环节,如:细胞代谢,增殖,分化,凋亡。免疫细胞功能的发挥和调节与miR同样密不可分。那么是否存在某些miR调控T细胞的衰竭,通过什机制进行调控,为明确这些问题,我们做了以下实验,为肿瘤免疫治疗提供新的思路。 研究目的 本研究拟从Lewis肺癌肿瘤模型中分离出衰竭性CD8+T淋巴细胞(CD8+PD-1+Tcell),并鉴定其功能。最后筛选出衰竭性T细胞和非衰竭性T细胞两群细胞差异性miR谱,并对其作用进行深入研究,为肿瘤免疫治疗提供新的思路。 研究内容和方法 1肿瘤局部浸润性CD8+T细胞分离与鉴定:建立lewis小鼠肿瘤模型,3周后利用研磨法获取肿瘤单细胞悬液,然后利用荧光活化细胞分选系统分选CD8+T细胞。 2CFSE检测细胞增殖情况:将流式分选得到的CD8+PD-1+Tcell和CD8+PD-1-Tcell分别标记CFSE,同时设不染色空白对照。分别在0天,1天,3天,5天,7天进行流式检测。 3检测CD8+PD-1+和CD8+PD-1-两群细胞IFN-γ分泌功能:分选后CD8+PD-1+Tcell和CD8+PD-1-Tcell,体外经PMA和离子毒素非特异性刺激5小时后,行细胞内因子染色,流式检测其IFN-γ的分泌功能。 4获取CD8+PD-1+和CD8+PD-1-两群细胞miRNAs谱:流式分选CD8+PD-1+和CD8+PD-1-两群细胞,然后送至上海康成生物工程有限公司进行miR检测。 研究结果 1肿瘤局部浸润性CD8+T细胞分离与鉴定 研究发现肿瘤局部确实存在肿瘤浸润性CD8+T淋巴细胞,为进一步明确CD8+T细胞亚群,复染PD-1,发现存在一CD8+T细胞亚群高表达衰竭性表型PD-1。 2CFSE检测细胞增殖情况 肿瘤浸润性CD8+PD-1+Tcell在0天,1天,3天,5天,7天这几个不同时间点增殖无明显变化,而CD8+PD-1-Tcell增殖明显较CD8+PD-1+Tcell活跃。 3检测CD8+PD-1+和CD8+PD-1-两群细胞IFN-γ分泌功能 结果显示CD8+PD-1+T细胞IFN-γ分泌能力明显降低。统计发现,荷瘤小鼠肿瘤局部CD8+PD-1-T细胞IFN-γ分泌能力较CD8+PD-1+T细胞强,但与正常小鼠脾脏中CD8+T细胞相比IFN-γ分泌能力亦明显下降。 4获取CD8+PD-1+和CD8+PD-1-两群细胞miRNAs谱 成功的获取了衰竭性T细胞和非衰竭性T细胞两群细胞差异性miR谱,发现有78条miR出现2倍以上的表达上调,68条miR出现2倍以上的表达下调。 结论 1.肿瘤局部存在一群浸润性衰竭性T细胞,约占80％左右,这些细胞表面高表达PD-1抑制性受体。这些表达PD-1衰竭性T细胞增殖功能以及杀伤功能明显减弱。 2.不仅肿瘤局部的TIL高表达PD-1抑制性受体,在荷瘤小鼠脾脏中有一定量的表达,但在正常小鼠脾脏中未见表达。 3.成功的获取了衰竭性T细胞(CD8+PD-1+)和非衰竭性T细胞(CD8+PD-1-)两群细胞差异性miR谱,发现有78条miR出现2倍以上的表达上调,68条miR出现2倍以上的表达下调。